兩個隱性營養不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變分析及產前診斷

徐哲 林志淼

100045北京，國際兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院皮膚科（徐哲）；北京大學第一醫院皮膚科（林志淼）

·論著·

兩個隱性營養不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變分析及產前診斷

徐哲 林志淼

100045北京，國際兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院皮膚科（徐哲）；北京大學第一醫院皮膚科（林志淼）

目的檢測2個隱性營養不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變情況，并在患兒母親再次妊娠時進行胎兒產前診斷。方法收集2例隱性營養不良型大皰性表皮松解癥患兒臨床資料，提取患兒及其父母的外周血DNA，應用PCR擴增COL7A1基因的全部118個外顯子并測序；用100例無血緣關系的健康人外周血作對照。確定致病突變后，在患兒母親再次妊娠時，羊膜腔穿刺術獲取羊水細胞。分別自直接抽提的羊水細胞以及培養后的羊水細胞中提取基因組DNA進行擴增和測序，檢測COL7A1基因突變，同患兒的檢測結果進行比較，行產前診斷。胎兒娩出后抽取靜脈血，檢測COL7A1基因突變。所有測序結果都經過雙向測序驗證。結果2例患兒均發現COL7A1基因復合雜合突變。例1 COL7A1基因存在c.5453G＞A及c.6781C＞T復合雜合突變，分別導致編碼氨基酸發生p.G1818D突變和產生提前終止密碼p.R2261Efs*25，其中c.5453G＞A來自父親，c.6781C＞T來自母親。例2 COL7A1基因存在c.6205C＞T及c.8272_8272delG復合雜合突變，導致編碼蛋白發生p.R2069C及p.V2758Sfs*28復合雜合突變，其中c.6205C＞T來自父親，c.8272_8272delG來自母親。2例患兒的母親再次懷孕時所取羊水細胞及羊水培養細胞均未測到患兒所攜帶的COL7A1基因突變。胎兒出生后皮膚黏膜正常，無水皰，基因檢測亦未發現患兒所攜帶的COL7A1基因突變。結論2例營養不良型大皰性表皮松解癥患兒均存在COL7A1基因復合雜合突變，并成功在2例患兒的母親再次妊娠時進行了產前診斷。

營養不良性大皰性表皮松解；產前診斷；DNA突變分析；膠原Ⅶ型；COL7A1基因

隱性營養不良型大皰性表皮松解癥（recessive dystrophic epidermolysis bullosa， RDEB， OMIM 609638）是一種常染色體隱性遺傳的大皰性皮膚病，是遺傳性大皰性表皮松解癥中嚴重的類型之一，由COL7A1基因突變導致其編碼的Ⅶ型膠原合成異常所致。患兒出生后即有皮膚脆性增加，以周身出水皰、糜爛、粟丘疹及愈后留下萎縮性瘢痕為特點［1］。對嚴重威脅到患者生命的RDEB而言，不但需要減少嚴重后遺癥的發生，更應設法阻止疾病在家族中遺傳。本研究中，我們對2例RDEB患兒進行基因檢測，并在患兒母親再次妊娠時進行產前診斷，阻斷疾病向下一代傳遞。

病歷資料

2例RDEB患兒均為散發病例，家族中未見類似患者，患兒父母臨床表型正常，非近親婚配。例1為2歲男童，出生時即有雙下肢廣泛皮膚缺失，累及小腿至足背（圖1），生后1周開始于頸部、臀部和四肢出現水皰和血皰。1歲后手足因萎縮性瘢痕而活動受限。口腔中亦反復發生水皰、大皰和糜爛，偶有嘔吐伴有聲嘶，手足甲板大部分脫落，毛發稀疏。生長發育水平處于同齡兒童低限，曾在當地行皮膚病理和電鏡檢查，診斷為大皰性表皮松解癥。例2為7歲女童，生后不久在腹部和面部各出現1處直徑4 cm皮膚缺失，出生后第2天開始吸吮母乳后口唇部位出現水皰，3 d后手背及足跟處出現水皰、大皰，易破潰糜爛。很快以腹部和腰部為主，周身廣泛出現水皰樣皮疹，指、趾甲經常脫落。3歲后，癥狀有所減輕，限于腋下、腹部和口周，可見數個水皰（圖2）。口腔及食道黏膜偶有破潰。智力及體格發育正常。

對水皰皮損行病理檢查，2例患兒均表現為棘層增厚，表皮下裂隙，真皮層纖維增生伴有淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤。結合臨床病史分析，2例患兒產科診斷為先天性皮膚缺損待查，臨床診斷為RDEB。

圖1 例1出生時脛骨前至足背皮膚缺失，上覆滲出性血痂

圖2 例2腹部及腹股溝處見瘢痕，其上見水皰及糜爛

方 法

1.外周血DNA提取：本研究通過國際兒童醫學中心首都醫科大學附屬北京兒童醫院醫學倫理委員會批準，在患兒母親計劃再次懷孕的半年前左右，取得患兒及其家屬的知情同意后，取患兒及其父母靜脈血4 ml置于乙二胺四乙酸抗凝管中，以QIAamp DNA Blood Mini試劑盒提取外周血基因組DNA。同時，在本院健康體檢者中隨機選取100例無關健康人，抽取外周血作為對照標本，提取標本DNA。

2.COL7A1基因外顯子PCR擴增：在UCSC數據庫中查取COL7A1基因的外顯子序列，根據文獻［2］，應用Primer5.0軟件對COL7A1基因的所有118個外顯子設計72對引物對其進行擴增，包括所有外顯子的編碼序列及側翼序列。PCR擴增體系為25 μl，含12.5 μl Takara premix PCR熱啟動酶（日本Takara公司產品），正反向引物各1 pmol，模板DNA 30 ng。PCR反應條件：98℃預變性5 min，98℃變性60 s、60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環35次，72℃延伸7 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收特異性目的條帶。

3.DNA測序：由北京天一輝遠生物科技有限公司對所得PCR產物測序，擴增片段均行正反向引物測序。將所有測序結果與Ensembl網站（http：//www.ensembl.org/index.html）公布的COL7A1基因序列進行對照。

4.羊水細胞培養：對例1的母親（于孕14周）和例2的母親（于孕16周）分別行羊膜腔穿刺術，取羊水40 ml，20 ml用于直接抽提胎兒基因組DNA，20 ml用于細胞貼壁培養，以去除穿刺術過程中可能的母體細胞污染。羊水抽出后，室溫下500×g離心6 min，取沉淀物加入10 ml培養液（L?DMEM+10%胎牛血清 +100 U/ml青霉素鉀 +100 μg/ml鏈霉素）、100 μl羊水細胞培養添加劑，制成細胞懸液，接種至直徑100 mm培養皿，置于37℃、5%C02培養箱中原代培養。靜置5 d后，無菌PBS漂洗傳代擴增，每3天更換培養液并傳代1次，傳代3次后，分離羊水培養細胞。

5.羊水及羊水培養細胞中COL7A1基因突變檢測：使用InstaGene Matrix試劑（美國 Bio?Rad公司）提取羊水及羊水培養細胞中胎兒DNA，通過PCR擴增和測序檢測COL7A1基因突變，步驟同“2.COL7A1基因外顯子PCR擴增”。

6.胎兒COL7A1基因突變檢測：2例患兒母親娩出胎兒后，取胎兒靜脈血，提取DNA，檢測COL7A1基因突變，步驟同“1.外周血DNA提取”和“2.COL7A1基因外顯子PCR擴增”，將所得結果與患兒結果比對。

結 果

1.PCR及產物電泳結果：患兒及其父母的靜脈血、羊水細胞、羊水培養細胞及娩出胎兒的靜脈血標本經PCR擴增后電泳，均在特定泳道內見到與預期片段長度相同的明亮條帶。100例無關健康對照標本均能擴增出與第63、86、39和111號外顯子片段長度對應的明亮條帶。

2.患兒測序結果：2例患兒均發現COL7A1基因復合雜合突變。例1 COL7A1基因第63號外顯子存在c.5453G＞A錯義突變，導致相應編碼氨基酸出現p.G1818D替代；第86號外顯子存在c.6781C＞T錯義突變，使氨基酸出現p.R2261*改變，產生終止密碼子，導致蛋白質翻譯提前終止。例2 COL7A1基因第39號外顯子存在c.6205C＞T錯義突變，編碼氨基酸出現p.R2069C替代；第111號外顯子存在c.8272_8272delG突變，導致編碼氨基酸出現p.V2758Sfs*28改變。所有突變測序結果都經過正反向測序得到驗證。100例無關健康人未發現COL7A1基因突變。見圖3、4。

3.患兒父母測序結果：例1 c.5453G＞A突變來自父親，c.6781C＞T突變來自母親。例2 c.6205C＞T突變來自父親，c.8272_8272delG突變來自母親。2例患兒父母均為攜帶相應突變的雜合子。

4.羊水細胞及羊水培養細胞基因測序結果：從例1、2的母親再次妊娠時抽取的羊水細胞及羊水培養細胞均未檢測到COL7A1基因突變。

圖3 隱性營養不良型大皰性表皮松解癥患兒COL7A1基因突變 3A、3B：例1的c.5453G＞A和c.6781C＞T突變；3C、3D：例2的c.6205C＞T和c.8272_8272delG突變。箭頭示突變位點

圖4 健康對照COL7A1基因PCR產物部分測序結果 4A～4D：健康對照在圖3A～3D所示區域的測序結果。箭頭示與患兒突變位點對應的正常位點

5.娩出胎兒突變檢測結果：2例患兒母親均分娩出臨床表型正常的新生兒，后續基因檢測示胎兒均未攜帶COL7A1基因突變。

討 論

目前，已報道的引起RDEB的突變包括錯義突變、移碼突變以及剪切位點突變等［3］。其中，在COL7A1基因編碼的Ⅶ型膠原三螺旋區位置引起甘氨酸替代的雜合錯義突變為RDEB最常見的基因突變。這是由于Ⅶ型膠原蛋白的結構特征是Gly?Xaa?Yaa連續重復，甘氨酸是最小的氨基酸，對于膠原蛋白的結構和功能至關重要。當甘氨酸被其他種類的氨基酸替代后，可能干擾Ⅶ型膠原的三螺旋結構域形成，妨礙其結構的完整性和穩定性，使皮膚基底膜致密板下帶錨纖維（其主要成分為Ⅶ型膠原）不能維持正常功能，導致RDEB發生［4?5］。

本研究明確了2例RDEB患兒的COL7A1基因突變位點，并在此基礎上用羊水細胞培養的方法對患兒母親，即COL7A1基因突變的攜帶者進行產前診斷，阻斷疾病在家系中向下一代遺傳。該2例患兒中，例1出生時雙小腿皮膚剝脫，與先天性皮膚發育不全、局限性真皮發育不良類似。所以臨床遇到類似皮疹表現的嬰兒時，應詳細詢問患兒出生時是否有水皰或皮膚剝脫等皮疹表現，對其進行長期隨訪，以鑒別不同類型的表皮松解癥。當高度懷疑患兒為重度RDEB時，直接進行基因測序確診更為經濟、高效和合理［6］。c.6781C ＞ T和c.8272_8272delG突變都會導致終止密碼子出現，這種突變直接可以確定為致病性突變。此外，c.6205C＞T錯義突變是HGMD 網站（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）報告過的突變位點，可使氨基酸出現p.R2069C突變。c.5453G＞A導致的p.G1818D雖然沒有報道過，但其是位于Ⅶ型膠原結構Gly?X?Y的甘氨酸突變，也是COL7A1最常見的致病性突變類型，綜上所述，可以確定兩個家系的突變位點都是致病性的。例2在生后和嬰兒期發生皮膚黏膜廣泛水皰，但在3歲后，水皰部位發生轉變，逐漸集中并局限于腋下、腹股溝等皮膚皺褶處。結合其突變位點（包括c.6205C＞T），例2應被診斷為反向型RDEB（recessive dystrophic epidermolysis bullosa?inversa，RDEB?I，OMIM 226600）。雖然此型RDEB患者皮疹逐步向皺褶部位轉移的原因不明，但c.6205C＞T幾乎是本型特有的COL7A1基因突變位點［7］。類似皮疹分布的疾病還有家族性良性天皰瘡，可能是因為褶皺部位局部皮膚溫度較高，蛋白酶降解速度與其他部位存在差異。

對于父母為COL7A1致病基因突變攜帶者的家庭而言，如果母親再次懷孕，胎兒有25%患本病的風險。REDB作為隱性遺傳病，患者具有復合雜合突變，而如果患者配偶不攜帶COL7A1基因突變，則后代為攜帶者，不表現出該疾病。由于已經明確基因突變位點，有再發風險的胎兒可在母親孕期進行羊水穿刺（最佳的羊膜腔穿刺時間是懷孕14～20周）及產前診斷，避免再次分娩出類似疾病的患兒。

［1］Jiang W,Sun TT,Lei PC,et al.Genotype?phenotype correlation in Chinese patients with dystrophic epidermolysis bullosa prurigi?nosa［J］.Acta Derm Venereol,2012,92（1）:50?53.DOI:10.2340/00015555?1178.

［2］Christiano AM,Hoffman GG,Zhang X,et al.Strategy for identifi?cation of sequence variants in COL7A1 and a novel 2?bp deletion mutation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.Hum Mutat,1997,10（5）:408?414.DOI:10.1002/（SICI）1098?1004（1997）10:5＜408::AID?HUMU12＞3.0.CO;2?3.

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Mutation analysis of the COL7A1 gene and prenatal diagnosis in two families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Xu Zhe,Lin Zhimiao
Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,National Center for Children′s Health,Beijing 100045,China（Xu Z）;Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China（Lin ZM）

Xu Zhe,Email:zhexu_cmu@163.com

ObjectiveTo detect mutations of the COL7A1 gene in 2 families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa（RDEB）,and to perform prenatal diagnosis during the pregnancy of patients′mothers.MethodsClinical data were collected from 2 patients with RDEB.DNA was extracted from the peripheral blood samples from the patients,their parents and 100 unrelated healthy people who served as controls.PCR was performed to amplify all the 118 exons of the COL7A1 gene followed by DNA sequencing.After identification of pathogenic mutations,amniotic fluid cells were obtained by amniocentesis during the next pregnancy of the patients′mothers,and genomic DNA was extracted from uncultured or cultured amniotic fluid cells followed by amplification and DNA sequencing to detect mutations in the COL7A1 gene.The results were compared with patients′results for prenatal diagnosis.After delivery,venous blood samples were collected from the neonates to detect mutations in the COL7A1 gene.All the results were verified by bidirectional sequencing.ResultsCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were identified in the 2 patients.Two heterozygous mutations（c.5453G ＞A and c.6781C＞T）in the COL7A1 gene were found in case 1,which resulted in the p.G1818D mutation and the formation of a premature termination codon p.R2261Efs*25.Additionally,the c.5453G＞A and c.6781C＞T mutations were inherited from his father and mother respectively.Another 2 heterozygous mutations（c.6205C＞T and c.8272_8272delG）in the COL7A1 gene were identified in case 2,which led to the p.R2069C and p.V2758Sfs*28 mutations in encoded proteins,and the c.6205C＞T and c.8272_8272delG mutations were inherited from the patient′s father and mother respectively.None of the above mutations in the COL7A1 gene was found in the uncultured or cultured amniotic fluid cells,which were collected from the 2 patients′mothers during the next pregnancy.After birth,the neonates showed normal skin and mucosa without blisters,and genetic testing showed none of the above mutations in the COL7A1 gene in the neonates.ConclusionCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were found in the 2 patients with RDEB,and prenatal diagnosis was successfully performed in the 2 patients′mothers during the next pregnancy.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Prenatal diagnosis;DNA mutational analysis;Collagen type VII;Gene,COL7A1

Fund programs:Beijing Municipal Natural Science Foundation（7162060）;Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support（ZYLX201601）;Basic and Clinic Science Foundation of Capital Medical University（16JL22）;Maternal and Child Health Foundation of Shunyi Women and Children′s Hospital of Beijing Children′s Hospital（FYJK201601）

徐哲，Email：zhexu_cmu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.009

北京市自然科學基金（7162060）；北京市醫院管理局臨床醫學發展專項（ZYLX201601）；首都醫科大學基礎臨床合作研究基金（16JL22）；北京兒童醫院順義婦兒醫院婦幼健康基金（FYJK201601）

2017?04?13）

尚淑賢）