X連鎖魚鱗病并發(fā)Meleda角化病一例臨床特征及SLURP?1和STS基因突變分析

王艷 汪慧君 林志淼 胡凌寒 潘玉雪 劉曉雁 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科［王艷（現(xiàn)在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，030001太原）、汪慧君、林志淼、胡凌寒、潘玉雪、楊勇］；首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院皮膚科（劉曉雁）

·論著·

X連鎖魚鱗病并發(fā)Meleda角化病一例臨床特征及SLURP?1和STS基因突變分析

王艷 汪慧君 林志淼 胡凌寒 潘玉雪 劉曉雁 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科［王艷（現(xiàn)在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，030001太原）、汪慧君、林志淼、胡凌寒、潘玉雪、楊勇］；首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院皮膚科（劉曉雁）

目的報道1例X連鎖魚鱗病并發(fā)Meleda角化病，并檢測其基因突變。方法收集臨床資料，提取患兒及其父母外周血基因組DNA，PCR擴增SLURP?1和STS基因全部外顯子及其側(cè)翼序列，以100例健康人作為對照，對擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對SLURP?1基因擴增產(chǎn)物進行DNA測序。結(jié)果患兒軀干、四肢泛發(fā)規(guī)則排列的棕褐色或黑色多角形鱗屑，掌跖、肘膝、腹股溝、肛周紅斑，過度角化，向背側(cè)延伸，診斷為X連鎖魚鱗病并發(fā)Meleda角化病。基因檢測提示，STS全基因缺失；SLURP?1基因第3外顯子第286位核苷酸發(fā)生C→T純合突變（c.286C＞T），導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)在第96位氨基酸出現(xiàn)終止改變（p.R96*），其父母均為c.286C＞T雜合突變攜帶者。健康對照未發(fā)現(xiàn)此突變。結(jié)論該患者攜帶STS全基因缺失和SLURP?1基因純合無義突變，可能是導(dǎo)致X連鎖魚鱗病并發(fā)Meleda角化病的原因。

鱗癬，X染色體連鎖；皮膚角化病，掌跖；突變；基因缺失；基因，STS；基因，SLURP?1

魚鱗病是一種常見的角化障礙性皮膚病，其中X連鎖魚鱗病（X?linked ichthyosis，XLI）發(fā)病率約1/6 000，屬于常見的遺傳性魚鱗病，一般只發(fā)生于男性，女性為攜帶者［1］。患者出生時或生后不久即發(fā)病，表現(xiàn)為全身皮膚干燥、粗糙，覆黑褐色鱗片，主要累及肢體伸側(cè)，也可累及屈側(cè)，頸部及耳前區(qū)受累為該病特征。Meleda角化病（mal de Meleda）是一種罕見的掌跖角化病（palmoplantar keratoderma，PPK），屬于常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為彌漫性掌跖增厚，累及手足背側(cè)及肘膝。我們報道首例XLI合并Meleda角化病的患兒，并對其進行致病基因檢測。

資料與方法

一、病歷資料

患兒男，4歲，出生時即有全身皮膚干燥，伴有脫屑，手足皮膚正常，生后5～6個月時，雙手掌、足底出現(xiàn)紅斑、皮膚增厚，逐漸加重，發(fā)展至手足背部，伴有多汗。2歲時肘膝出現(xiàn)紅色角化性斑塊，并累及雙側(cè)腹股溝、臀部等部位，無自覺不適。患兒無魚鱗病及掌跖角化病家族史。父母體健，為同一鎮(zhèn)人，否認近親結(jié)婚，患兒有2姐，均體健。體檢：各系統(tǒng)檢查無異常。皮膚科檢查：全身皮膚干燥，頭皮、頸部、軀干、四肢泛發(fā)棕褐色或黑色多角形、黏著性鱗屑，排列規(guī)則，腹部較背部為重；雙手掌、足底融合性角質(zhì)增生性斑塊，呈蠟樣黃色，上有脫屑及皸裂，向手足背部延伸，邊緣發(fā)紅，雙側(cè)肘部、腹股溝、陰囊、肛周、雙膝伸側(cè)、腘窩、雙踝散發(fā)大小不等境界清楚的紅色角化性斑塊，手指皮膚增厚角化，可見收縮帶，指趾間散在白色浸漬，手足活動正常，功能不受限（圖1、2）。根據(jù)患兒頸部、軀干和四肢出現(xiàn)大而黑的魚鱗樣黏著性鱗屑，腹部受累較背部更多，呈進行性加重，手、足、肘、膝角化性斑塊，伴有越線現(xiàn)象，臨床診斷為XLI并發(fā)Meleda角化病。經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)信息咨詢中心檢索證明，國內(nèi)外檢索暫未發(fā)現(xiàn)與本研究內(nèi)容相同的文獻報道。患兒外用10%尿素乳膏后，皮膚干燥、脫屑及手、足、肘、膝角化明顯減輕。

二、方法

1.外周血基因組DNA提取：本研究通過北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。取患兒、父母和100例健康對照外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用試劑盒提取基因組DNA（北京天根生化科技有限公司）。

2.PCR引物設(shè)計和合成：根據(jù)SLURP?1、STS基因序列（http：//www.ensembl.org/index.html），用Primer?BLAST 在 線 版（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer?blast/）SLURP?1設(shè)計3對引物（表1），STS設(shè)計10對特異性引物（表2），覆蓋上述2條基因的所有外顯子及側(cè)翼序列，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

圖1 患兒X連鎖魚鱗病皮損表現(xiàn) 1A：腹部、上肢多角形鱗屑；1B：雙下肢伸側(cè)黏著性黑色鱗屑；1C：雙下肢屈側(cè)皮膚干燥，泛發(fā)黑色鱗屑

圖2 患兒Meleda角化病皮損 2A：手掌黃色角化性斑塊、皸裂、脫屑，彌漫至手腕部，邊緣發(fā)紅；2B：足背紅斑；2C：腹股溝、陰囊紅斑；2D：雙膝伸側(cè)角化性斑塊

表1 SLURP1引物序列

3.PCR反應(yīng)體系及條件：擴增用法國Transgene公司的2倍EasyTaq PCR SuperMix（批號AS111?11），反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s（每個循環(huán)依次降0.6℃），72℃延伸30 s，10個循環(huán)；94℃變性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。取5 μl PCR擴增產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4.PCR產(chǎn)物測序分析：SLURP?1 PCR產(chǎn)物純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序，測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法。測序結(jié)果采用Bioedit軟件與SLURP?1基因組序列進行比對。

表2 STS引物序列

結(jié) 果

一、STS基因PCR擴增結(jié)果

見圖3。瓊脂糖凝膠電泳顯示，10對引物所擴增的陽性對照（健康人）均得到對應(yīng)條帶，患兒及陰性對照（ddH2O）無條帶出現(xiàn)，表明該患兒STS全基因缺失。

二、測序結(jié)果

將SLURP?1所測序列與Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//ensembl.org/index.html）公布的正常序列進行比對，結(jié)果示SLURP?1基因第3外顯子中第286位核苷酸（從cDNA編碼起始位點ATG算起）發(fā)生C→T純合突變（c.286C＞T）（dbSNP：rs121908317），導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)在第96位氨基酸出現(xiàn)無義突變（p.R96*）（圖4A）。健康對照未出現(xiàn)此突變（圖4C），父母經(jīng)檢測為c.286C＞T雜合突變攜帶者（圖4B）。所有突變均由反向測序得到驗證。

圖3 STS基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 M：標準參照物；1～10：外顯子1～10；p：患兒DNA擴增產(chǎn)物；+：健康人陽性對照；-：陰性對照

討 論

XLI為X染色體連鎖隱性遺傳，患者幾乎均為男性，沒有明顯的種族或地域差異。90%的XLI患者在生后第1周即出現(xiàn)全身皮膚干燥、脫屑，頸部、軀干、四肢逐漸出現(xiàn)大而黑的多角形黏著性鱗屑，屈側(cè)受累明顯，手足皮膚正常，癥狀不隨年齡增長而減輕，皮膚外表現(xiàn)包括角膜混濁、睪丸腫瘤、隱睪等。尋常性魚鱗病患者身體屈側(cè)及頸部不受累，常伴掌跖皮紋增多及毛周角化癥，可與XLI鑒別。本文患兒為男性，出生即有全身皮膚干燥，隨年齡增長進行性加重，出現(xiàn)頸部、腹部及四肢大而黑的多角形鱗屑，腹部受累較背部明顯，且向下延伸至小腿伸側(cè)，符合XLI臨床表現(xiàn)。

圖4 SLURP?1基因突變測序圖 4A：患兒SLURP?1第3外顯子第286位核苷酸發(fā)生純合突變（C.286C＞T）；4B：患兒父親為C.286C＞T雜合突變攜帶者；4C：健康人測序結(jié)果

1978年，Webster等［2］發(fā)現(xiàn)，XLI與皮膚缺乏類固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase，STS）有關(guān)；1987年，STS基因缺失被確定為XLI的病因［3］。正常情況下，STS主要存在于角質(zhì)層細胞膜中，此酶的主要功能是將角質(zhì)層中的膽固醇硫酸鹽水解，膽固醇硫酸鹽已證明在保持膜的完整性以及維持角質(zhì)層的正常脫落中起重要作用［4］。當STS缺乏時，角質(zhì)層的膽固醇硫酸鹽不能被分解，出現(xiàn)鱗屑堆積；另一方面膽固醇硫酸鹽分解過程被阻斷，皮膚的屏障作用也受到干擾，pH值下降，角質(zhì)層黏附性增加，進一步使角質(zhì)層細胞滯留，促進鱗屑堆積，從而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)［5］。文獻表明，90%的XLI患者STS全基因缺失［6?7］。我們采用擴增STS 10對外顯子的方法確定患兒為STS全基因缺失，與文獻報道一致，結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)及基因檢測結(jié)果，進一步明確XLI的診斷。2010年西班牙研究者對40例XLI患者進行STS基因檢測，發(fā)現(xiàn)部分缺失率達25%，而基因缺失程度與表型之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性［6］。

Meleda角化病是一個罕見的常染色體隱性遺傳性掌跖角化病，在1826年由Luca Stulli在亞得里亞海的Meleda島首次發(fā)現(xiàn)，1898年才由Neumann首次報道［8］，其患病率約為1/10萬［9］。臨床表現(xiàn)有口周紅斑、跨關(guān)節(jié)部位皮膚的角化過度性斑塊、指甲畸形、浸漬多汗伴有惡臭、指過短、假指等［10］。長島型掌跖角化病也為早期出現(xiàn)的掌跖部位彌漫性紅斑及角化，伴有越線現(xiàn)象，但皮疹穩(wěn)定，不隨年齡增長出現(xiàn)明顯進展或加重。Olmsted綜合征口周紅斑更嚴重，并伴有殘肢現(xiàn)象。該患兒出生后5～6個月時出現(xiàn)掌跖角化，并逐漸累及手背、足背、陰囊、肛周、腹股溝及腘窩等部位，伴有多汗、浸漬，無殘肢現(xiàn)象，根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷為Meleda角化病。

2001年，F(xiàn)ischer等［11］確認Meleda角化病為編碼SLURP?1蛋白的基因突變所致。這類蛋白是分泌Ly?6/uPar蛋白超家族中的一員。SLURP?1 3D結(jié)構(gòu)含有3個結(jié)構(gòu)域，5個雙硫鍵，這對其正確折疊行使功能至關(guān)重要。迄今為止，全世界不同人群中已檢測到16個SLURP?1基因的致病突變位點［12］。本文患兒SLURP?1第3外顯子中第286位核苷酸C→T發(fā)生純合無義突變（c.286C＞T），該突變在Fischer等關(guān)于Meleda角化病患者基因突變研究的文獻中曾被報道［11］，亦證實該患兒Meleda角化病診斷。SLURP?1被認為是晚期上皮分化的標志，參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的生長、增殖、分化和凋亡［13］，廣泛分布于人體皮膚、宮頸、牙齦、胃和食管，尤其在掌跖的角質(zhì)形成細胞中含量最高。SLURP?1是α?7煙堿乙酰膽堿受體的內(nèi)源性配體，具有促凋亡活性［14］。當SLURP?1蛋白失活時，由于角質(zhì)形成細胞凋亡不能被正常調(diào)控，導(dǎo)致皮膚高度角化。SLURP?1還有抑制巨噬細胞和角質(zhì)形成細胞釋放腫瘤壞死因子α的功能。Meleda角化病患者缺乏SLURP?1蛋白會導(dǎo)致腫瘤壞死因子α的釋放及隨后的炎癥介質(zhì)不能被正常調(diào)控［15］，從而引起持續(xù)炎癥，這和很多腫瘤形成有關(guān)，包括惡性黑素瘤。既往認為Meleda角化病除在亞得里亞海的Meleda島有較高發(fā)病率外，中東和地中海地區(qū)也有，在這些地區(qū)近親結(jié)婚較常見，提示祖先效應(yīng)［10］。截至目前已有包括阿爾及利亞、土耳其、巴勒斯坦、巴基斯坦、中國臺灣、德國、蘇格蘭、日本、利比亞等多達10余個國家的病例報道［16?17］。2016年我國Zhang等［12］首次報道兩個通過基因檢測確診為Meleda角化病的家系，3例患者均發(fā)生c.256G＞A錯義突變。

部分魚鱗病可以伴有掌跖角化，但是XLI和Meleda角化病具有不同的遺傳方式，同時出現(xiàn)于同一個患者，國內(nèi)外尚未見報道，其具體機制不明。該患兒無魚鱗病及掌跖角化病家族史，同胞兩姐均正常，父母親否認近親結(jié)婚，但是均攜帶相同的SLURP?1基因雜合突變，考慮原因為雙方均出生在人口僅為1 000余人的同一小鎮(zhèn)，可能存在較近的血緣關(guān)系。目前魚鱗病與掌跖角化病治療主要是口服維A酸類藥物，或者外用角質(zhì)剝脫劑、潤膚劑等。本例患兒XLI和Meleda角化病臨床表現(xiàn)均較嚴重，可能與SLURP?1基因突變和STS基因缺失發(fā)生在同一患兒從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。

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A case of X?linked ichthyosis complicated by Mal de Meleda:clinical features and mutation analysis of the SLURP?1 and STS genes

Wang Yan,Wang Huijun,Lin Zhimiao,Hu Linghan,Pan Yuxue,Liu Xiaoyan,Yang Yong
Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China（Wang Y［current affiliation:Department of Dermatology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China］,Wang HJ,Lin ZM,Hu LH,Pan YX,Yang Y）;Department of Dermatology,Children′s Hospital,Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,China（Liu XY）

Yang Yong,Email:dryongyang@bjmu.edu.cn

ObjectiveTo report a case of X?linked ichthyosis complicated by Mal de Meleda,and to identify the gene mutations.MethodsClinical data were collected from the patient,and peripheral blood samples were obtained from the patient,his parents and 100 unrelated healthy people who served as controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples,and PCR was performed to amplify all the exons and their flanking sequences of the SLURP?1 and STS genes.All the amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis,and amplification products of the SLURP?1 gene were analyzed by DNA sequencing.ResultsThe patient presented with regularly?arranged polygonal brown or black scales all over the trunk and limbs,erythematous hyperkeratotic lesions on the palms and soles,elbows and knees,inguinal and perianal regions,which extended to the dorsa of the hands and feet.Then,the patient was diagnosed with X?linked ichthyosis complicated by Mal de Meleda.Genetic testing showed complete deletion of the STS gene,and a homozygous mutation（c.286C ＞ T）at position 286 in exon 3 of the SLURP?1 gene,which led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 96（p.R96*）.His parents were heterozygous carriers of the mutation（c.286C ＞ T）.No mutation was found in the unrelated healthy controls.ConclusionThe complete deletion of the STS gene and the homozygous nonsense mutation in the SLURP?1 gene may be the reason for X?linked ichthyosis complicated by Mal de Meleda in the patient.

Ichthyosis,X ?linked;Keratoderma,palmoplantar;Mutation;Gene deletion;Gene,STS;Gene,SLURP?1

楊勇，Email：dryongyang@bjmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.008

2017?06?22）

吳曉初）