普萘洛爾對體外培養血管瘤內皮細胞的影響及其分子機制

羅勇奇 曾迎紅 胡夢葉 湯建萍

410007長沙，湖南省兒童醫院皮膚科（羅勇奇、曾迎紅、湯建萍）；湖南省人民醫院心電圖室（胡夢葉）

·論著·

普萘洛爾對體外培養血管瘤內皮細胞的影響及其分子機制

羅勇奇 曾迎紅 胡夢葉 湯建萍

410007長沙，湖南省兒童醫院皮膚科（羅勇奇、曾迎紅、湯建萍）；湖南省人民醫院心電圖室（胡夢葉）

目的研究普萘洛爾對體外培養的血管瘤內皮細胞（HemEC）增殖及凋亡的影響，探討其分子機制。方法收集7例增生期血管瘤患兒的手術切除血管瘤組織用于體外培養HemEC，同時培養人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）作為對照。采用0、25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾分別處理兩種細胞24、48、72 h。MTT法檢測各組細胞的存活率，流式細胞儀檢測凋亡率。采用含或不含100 μmol/L普萘洛爾的培養基分別培養HemEC（分別為普萘洛爾干預組及空白對照組）18 h，提取兩組細胞總RNA，采用表達譜基因芯片技術檢測兩組HemEC中差異表達的基因，并通過實時定量PCR驗證。結果25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h可引起HemEC輕微增殖（P＜0.05），而≥100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降，作用≥48 h可引起HUVEC存活率下降。100～150 μmol/L普萘洛爾作用24～72 h，HemEC細胞存活率比HUVEC低（P＜0.05）。100～150 μmol/L普萘洛爾作用下，HemEC凋亡率隨普萘洛爾作用時間及濃度逐漸升高（均P＜0.05）。普萘洛爾干預HemEC后，表達譜基因芯片技術篩選出186個表達差異倍數≥1.5的基因，其中表達明顯上調的基因128個，明顯下調的58個。實時定量PCR顯示，普萘洛爾干預組前蛋白轉化酶枯草溶菌素9 mRNA表達水平為空白對照組的（9.88±2.19）倍，脂肪酸結合蛋白3 mRNA為（21.90±8.18）倍，差異均有統計學意義（t=7.028、4.427，P＜0.05）。結論高濃度普萘洛爾對HemEC及HUVEC的增殖均有抑制作用，且對HemEC的抑制作用更強。普萘洛爾抑制HemEC的增長可能與抑制HemEC增殖及促進其凋亡有關。

血管瘤；普萘洛爾；細胞增殖；細胞凋亡；基因表達譜；寡核苷酸序列分析

自2008年Léauté?Labrèze等［1］發現普萘洛爾能有效治療血管瘤后，其已成為血管瘤的一線治療藥物，但治療機制仍不清楚。我們研究普萘洛爾對體外培養的血管瘤內皮細胞（hemangioma endothelial cells，HemEC）增殖及凋亡的影響，同時采用人表達譜芯片篩選普萘洛爾干預體外HemEC前后差異表達基因，尋找普萘洛爾的作用靶點，探討其治療血管瘤的分子機制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

微血管內皮細胞（EGM?2 MV）培養基（瑞士Lonza公司），DMEM高糖細胞培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素（美國Gibco公司）；抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗體、熒光二抗（美國Abcam公司），MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司），鹽酸普萘洛爾（分析純，美國Sigma公司）；CD31免疫磁珠、MACS磁珠分選器、細胞凋亡試劑盒（德國美天旎生物技術有限公司），FACsort流式細胞儀（美國BD公司）；人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人皮膚成纖維細胞由湘雅醫院細胞中心惠贈。

二、HemEC的原代培養及鑒定

血管瘤標本來源于湖南省兒童醫院外科7例手術切除的增生期血管瘤組織，患兒年齡≤6個月，并已征得患兒家長知情同意。收集的血管瘤組織一部分留作病理檢查，一部分用于HemEC原代培養：①消毒血管瘤組織，用含青鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入分散酶Ⅱ（2.4 U/ml）溶液5 ml，4℃冰箱消化過夜（12～18 h）；②第2天去除分散酶Ⅱ溶液，PBS洗2遍，移至10 cm培養皿中，去除瘤體周圍表皮及真皮，剪成1 mm3后置入15 ml離心管中，加0.2%Ⅰ型膠原酶10 ml，放至37℃水浴鍋，每隔15 min劇烈振蕩1次，消化2～3 h，直至呈乳糜狀；③用70 μm無菌濾網過濾去除殘余血管瘤組織，170×g離心5 min，棄上清液，用5 ml 0.1%牛血清白蛋白（BSA）反復重懸細胞，吹打混勻，離心，用血球計數板計數；④每1×107個細胞加入60 μl 0.1%BSA溶液重懸，加30 μl Fc受體（FcR）抑制劑混勻，加30 μl CD31磁珠，放入4 ℃冰箱，孵育15 min；然后每1×107個細胞加入0.1%BSA溶液1 ml，按試劑說明進行磁珠分選，收集到離心管內的細胞懸液為CD31陽性細胞，即HemEC，然后13 523×g離心5 min，棄上清液；⑤用4 ml含20%胎牛血清的EGM?2培養基（EGM?2/20%FBS）重懸，計數；先用1 mg/L纖維黏連蛋白溶液包被25 cm2細胞培養瓶，以5×103個/cm2密度將細胞置于培養瓶中，在CO2培養箱內靜置培養24 h，48 h后更換培養液，以后每3天更換1次培養液，倒置顯微鏡下觀察并拍照；⑥細胞培養20～25 d達90%融合，按1∶3傳代。以原代培養的HemEC為實驗組，以DMEM培養基培養的人皮膚成纖維細胞作為陰性對照組，制作細胞爬片，采用vWF抗體和hoechst33342核酸染料和免疫熒光染色鑒定。

三、普萘洛爾干預細胞實驗分組及藥物配制

取6個無菌離心管，用EGM?2/0.5%FBS培養基分別配制25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾溶液，現配現用。實驗分為HemEC組和HUVEC組，每組又分為藥物干預組和空白對照組。藥物干預組又分為25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾6組，空白對照組只加入相同量EGM?2/0.5%FBS培養基（不添加生長因子）。

四、MTT法檢測細胞增殖活性

消化處于對數生長期的HemEC、HUVEC，分別以每孔1×105個/ml的細胞懸液接種于96孔板，培養24 h后去上清液，各孔分別加入不同濃度普萘洛爾200 μl，空白對照組加不含藥物的EGM?2/0.5%FBS培養基200 μl，再次培養24 ～ 72 h，每組設3個復孔。加藥物2 h后于顯微鏡下觀察細胞狀態并拍照。分別在培養24、48、72 h后，加入5 g/L MTT溶液（50 μl/孔）繼續培養4 h。用酶標儀測定波長490 nm處吸光度（A）值。細胞存活率=｛1－［（實驗孔A值－調零孔A值）－（對照孔A值－調零孔A值）］/（對照孔A值－調零孔A值）｝×100%。

五、流式細胞儀檢測細胞凋亡

消化處于對數生長期HemEC和HUVEC，調整細胞密度為1×105個/ml，按2 ml/孔加入6孔板。培養12 h后待細胞貼壁，吸去培養基，各孔分別加入含不同濃度普萘洛爾的EGM?2/0.5%FBS培養基2 ml，空白對照組加不含藥物的相同培養基2 ml，再次培養24～72 h。分別在24、48、72 h后，吸去培養基，PBS溶液洗1次，加入0.5 ml不含乙二胺四乙酸胰酶消化細胞。當鏡下細胞變圓、部分漂浮時，加1 ml完全培養基終止消化，收集細胞懸液至流式管中，170×g離心5 min，棄上清液。加入3 ml PBS重懸洗滌細胞1次，170×g離心5 min，棄上清液。加入200 μl結合緩沖液懸浮細胞。加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（AnnexinV?FITC）5 μl，避光室溫孵育15 min。加5 μl碘化丙錠（PI）染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

六、表達譜基因芯片技術檢測普萘洛爾干預HemEC前后的基因表達差異

選取3例患者生長良好的第2代HemEC，標記為HemEC?1、HemEC?2、HemEC?3，每例患者細胞分為實驗組與對照組，共6組細胞。調整細胞密度約為1.0×106/孔，接種于6孔板，培養24 h。當培養板可見細胞鋪滿80%后，實驗組加入含100 μmol/L普萘洛爾的EGM?2/0.5%FBS培養基2 ml，不加細胞因子，對照組加入不含藥物的相同培養基2 ml，培養18 h。棄去培養基，PBS洗3次，每孔加入1 ml Trizol裂解液，用無菌注射器反復吹打細胞，直至細胞全部溶解。13 523×g離心1 min，吸取上清液轉移到無酶離心管中，-80℃冰箱保存、備用。按試劑說明分別提取總RNA并純化，采用Nano Drop儀器檢測RNA濃度及A260/A280比值。將純化的RNA送上海伯豪生物技術有限公司采用Agilent G3 Human 8*60K芯片進行表達譜基因芯片檢測，對結果進行GO分析和Pathway分析，選擇差異大且與增殖或凋亡相關的基因，實時定量PCR驗證。

七、統計學處理

除原代細胞培養和表達譜基因芯片檢測實驗外，其他實驗均重復3次，結果用±s表示。采用SPSS19.0軟件，兩個獨立樣本均數比較采用兩樣本t檢驗，對重復測量設計資料數據采用多因素重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人HemEC培養

7例的血管瘤組織中有3例成功培養出HemEC。原代內皮細胞培養5 h后開始貼壁，倒置相差顯微鏡下HemEC呈梭形、多角形，而HUVEC相對偏圓，細胞體積偏大。培養24 h后，HemEC開始分裂增殖，培養基表面浮有一部分未貼壁細胞。原代細胞前期增殖較緩慢，第14天時鏡下可見培養瓶底部貼壁生長的細胞密度仍然比較稀疏，之后增殖速度增快，第20天時鏡下見HemEC漩渦狀增殖，排列較整齊、密集，此時生長達90%融合，見圖1。傳代后的HemEC增殖活躍。

熒光顯微鏡下，實驗組細胞和陰性對照組成纖維細胞胞核均出現藍色熒光；實驗組細胞胞質內出現vWF的綠色熒光，以核周為主，而陰性對照組人成纖維細胞vWF染色呈陰性，證明此實驗組細胞確為HemEC。見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察從血管瘤組織分離培養的血管瘤內皮細胞（HemEC）形態（×200） 1A：培養第14天，可見稀疏的梭形或多角形HemEC，約占培養瓶底的30%；1B：培養第20天，可見旋渦狀密集排列的梭形細胞，細胞生長超過培養瓶底的90%

二、普萘洛爾干預后細胞形態和細胞增殖活性變化

用0～150 μmol/L普萘洛爾處理HemEC和HUVEC 2 h后，HemEC形態隨藥物濃度的遞增而變化，可見細胞皺縮、變圓，脫壁漂浮，高濃度時甚至細胞輪廓消失；而HUVEC形態在低濃度時變化不明顯，普萘洛爾濃度遞增到100 μmol/L后，細胞開始出現皺縮、變圓，少許脫壁漂浮。

圖2 vWF抗體免疫熒光染色法鑒定血管瘤內皮細胞（HemEC）（×400） HemEC胞核hoechst33342染色陽性（藍色熒光），胞質vWF染色陽性（綠色熒光）；人成纖維細胞胞核hoechst33342染色陽性（藍色熒光），vWF染色陰性（綠色熒光）

對不同濃度普萘洛爾作用后HemEC及HUVEC的存活率數據進行Mauchly球性檢驗，顯示P=0.134，滿足協方差矩陣球性檢驗，不需要對結果進行校正。25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h，可引起HemEC輕度增殖（F=6.06，P＜ 0.05）；≥ 100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降；而普萘洛爾濃度≥100 μmol/L、作用時間≥48 h才可引起HUVEC存活率下降。100～150 μmol/L普萘洛爾作用24～72 h對HemEC的抑制作用大于HUVEC，HemEC細胞存活率更低（100 μmol/L時，F=7.68；125 μmol/L 時，F=17.13；150 μmol/L 時，F=18.23；均P＜ 0.05），見圖3、4。

圖3 不同濃度普萘洛爾干預血管瘤內皮細胞（HemEC）后細胞存活率曲線 25 μmol/L普萘洛爾可引起HemEC輕微增殖，中高濃度萘洛爾則會引起HemEC存活率下降

圖4 不同濃度普萘洛爾干預人臍靜脈內皮細胞后細胞存活率曲線

三、普萘洛爾干預后HemEC凋亡率變化

對不同濃度普萘洛爾干預不同時間后HemEC凋亡率數據進行Mauchly球性檢驗，顯示P=0.059，滿足協方差矩陣球性檢驗。不同普萘洛爾濃度誘導的HemEC凋亡率差異有統計學意義（F=664.96，P＜0.05），不同干預時間凋亡率差異亦有統計學意義（F=572.15，P＜0.05）。不同濃度普萘洛爾與不同干預時間存在交互作用，即不同濃度普萘洛爾作用下HemEC凋亡率隨時間的變化趨勢不同（F=85.25，P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，100～150 μmol/L普萘洛爾作用下，HemEC凋亡率隨時間及濃度均逐漸升高（均P＜0.05）。見表1。

四、普萘洛爾干預前后HemEC基因表達譜變化

普萘洛爾干預HemEC后進行芯片篩選，差異倍數≥1.5的基因有186條，其中明顯上調的有128條，明顯下調的58條。差異倍數＞2的基因有21條，見表2。對基因芯片結果進行GO分析和Pathway分析，并查閱這些基因的相關功能和研究進展，發現差異倍數＞2的基因涉及下列功能：①細胞的增殖、凋亡；②細胞的活化、分化周期；③信號轉導；④類固醇生物合成；⑤脂類生物合成；⑥DNA復制、損傷修復。其中，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）、脂肪酸結合蛋白3（fatty acid binding protein 3，FABP3）基因表達顯著上調，并分別為對照組的3.22倍與10.14倍，PCSK9、FABP3均與凋亡相關。以GAPDH為內參，實時定量PCR結果顯示，普萘洛爾干預后HemEC的PCSK9、FABP3 mRNA表達顯著高于對照組，差異倍數分別為9.88±2.19和21.90±8.18，差異均有統計學意義（t值分別為7.028、4.427，P＜ 0.05），與芯片檢測結果相符。

表1 不同濃度普萘洛爾干預不同時間后血管瘤內皮細胞（HemEC）凋亡率 %，±s

表1 不同濃度普萘洛爾干預不同時間后血管瘤內皮細胞（HemEC）凋亡率 %，±s

注：n=5

普萘洛爾0 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L 75 μmol/L 100 μmol/L 125 μmol/L 150 μmol/L 24 h 2.63±0.08 4.68±0.16 9.40±0.29 13.27±1.03 18.93±1.60 22.12±1.88 31.98±2.57 48 h 3.19±0.19 6.75±0.27 10.82±0.28 17.97±3.28 46.77±7.66 54.30±2.21 61.68±2.22 72 h 5.64±0.13 9.34±0.41 11.61±0.49 18.21±1.23 56.87±4.14 63.95±1.50 70.89±3.57

討 論

臨床研究表明，普萘洛爾治療嬰兒血管瘤療效顯著［2?5］，但其作用機制仍不明確。Chim等［6］體外培養HemEC，用普萘洛爾干預后其細胞活力、遷移能力下降，且濃度越高作用越強。Annabi等［7］在體外培養人大腦微血管內皮細胞，普萘洛爾干預后血管生成明顯減少，可能與抑制基質金屬蛋白酶9（MMP?9）分泌及內皮細胞生成有關。HemEC過度增殖是血管瘤最特征性的病理改變，是血管瘤發病的中心環節。目前認為普萘洛爾治療嬰兒血管瘤可能與抑制HemEC增生，促進其凋亡有關。

本研究顯示，普萘洛爾干預后HemEC和HUVEC細胞形態均出現變化，可見細胞皺縮、變圓，脫壁漂浮。在普萘洛爾低濃度時，HemEC即出現明顯的形態變化，而HUVEC形態變化不明顯；當普萘洛爾濃度達到100 μmol/L后，HUVEC開始出現明顯形態改變，說明HemEC對普萘洛爾的作用比HUVEC敏感。細胞增殖實驗顯示，≥100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降，這與既往研究相似［8］。Chim等［6］推測普萘洛爾通過抑制缺氧誘導因子1α（HIF?1α）途徑降低血管內皮生長因子（VEGF）活性，導致PI3/Akt和p38/MAPK下調，抑制HemEC的增生。Ji等［9］發現，β受體激動劑異丙腎上腺素可通過增加HemEC中血管內皮生長因子（VEGF）的表達和VEGF受體2的活性，促進HemEC增生，從反面印證β受體阻滯劑普萘洛爾有抑制HemEC增生的作用。魏珩等［10］發現，普萘洛爾抑制內皮細胞的增殖可能與抑制MMP?2、MMP?9的表達有關。

表2 普萘洛爾干預血管瘤內皮細胞（HemEC）前后部分差異表達基因（差異倍數≥2）

本研究結果顯示，當100～150 μmol/L普萘洛爾作用48 h以上時，HUVEC存活率也出現下降，表明普萘洛爾也可抑制HUVEC增生，只是需要更高的濃度和作用時間，這為臨床上采用普萘洛爾治療靜脈畸形提供了理論基礎。此外，25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h只能引起HemEC輕微增殖，提示臨床上采用普萘洛爾治療血管瘤的劑量不能太小。

目前，對普萘洛爾作用機制的研究還局限于對血管形成相關因子及細胞凋亡的影響，未能從整體上找出作用的靶點、途徑及分子機制。人表達譜基因芯片能一次性大規模、全自動檢測數萬基因，已廣泛應用于基因檢測、基因功能等的研究。張莉等［11］采用基因表達譜芯片技術檢測血管瘤增生期與消退期之間差異表達的基因，結果顯示，在血管瘤增生期一些原癌基因和生長因子表達上調，而消退期促凋亡基因和信號通路上調，表明血管瘤的消退與凋亡相關。本研究顯示，普萘洛爾干預前后HemEC有明顯表達差異的基因有186個，PCSK9、FABP3、BBC3、E2F2、TSC22D3、AATK、PLEKHF1、PRUNE2、TRIB3等基因涉及細胞增殖、凋亡及調控，DDIT3、ERCC5等基因涉及DNA復制、損傷修復，SQSTM1、YWHAE、ErbB3等涉及信號轉導，DHCR24、DHCR7、HSD17B7、LSS等涉及類固醇生物合成，ELOVL6、FADS1等基因涉及脂類生物合成。提示普萘洛爾抑制HemEC增殖、促進其凋亡是細胞代謝、生長調控、信號傳導、細胞周期、類固醇生物合成、脂類生物合成等多個基因靶位綜合作用的結果，但其中每個基因發揮的具體作用及作用途徑仍不清楚，需要進一步研究。人表達譜芯片檢測結果為進一步研究普萘洛爾治療血管瘤的分子機制提供了重要依據。我們將進一步探討普萘洛爾治療血管瘤的作用靶點，揭示其作用的分子機制，為普萘洛爾治療血管瘤提供更有力的理論依據。

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Effects of propranolol onin vitrocultured hemangioma endothelial cells and their mechanisms

Luo Yongqi,Zeng Yinghong,Hu Mengye,Tang Jianping
Department of Dermatology,Hunan Children′s Hospital,Changsha 410007,China（Luo YQ,Zeng YH,Tang JP）;Department of Electrocardiography,Hunan Provincial People′s Hospital,Changsha 410002,China（Hu MY）

Tang Jianping,Email:jpingtang@126.com

ObjectiveTo evaluate effects of propranolol on the proliferation and apoptosis ofin vitrocultured hemangioma endothelial cells（HemEC）,and to explore their molecular mechanisms.MethodsHemangioma tissues were resected from 7 children with proliferative hemangioma,and used forin vitroculture of HemEC.Meanwhile,cultured human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）served as controls.The 2 kinds of cells were treated with propranolol at different concentrations of 0,25,50,75,100,125 and 150 μmol/L for 24,48 and 72 hours separately.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,and flow cytometry to determine the apoptosis rate.Some cultured HemEC were divided into 2 groups to be treated with 100 μmol/L propranolol?containing culture medium（propranolol group）and culture medium alone（blank control group）,respectively,for 18 hours.Total RNA in the 2 groups was extracted separately.Differentially expressed genes in HemEC between the above 2 groups were identified by DNA microarray technology,and verified by real?time quantitative PCR.ResultsThe treatment with 25 μmol/L propranolol for 24 and 48 hours caused a slight proliferation of HemEC（P＜ 0.05）.The survival rate of HemEC was decreased after the treatment with propranolol at the concentration of≥ 100 μmol/L for more than 24 hours,while the proliferation of HUVEC was inhibited by the treatment with propranolol at the concentration of ≥ 100 μmol/L for more than 48 hours.During 24-72 hours of treatment with 100-150 μmol/L propranolol,the survival rates of HemEC were significantly lower than those of HUVEC（P＜ 0.05）.After the treatment with 100-150 μmol/L propranolol,the apoptosis rate of HemEC gradually increased with the increase in treatment duration and concentrations of propranolol（allP＜ 0.05）.Compared with the blank control group,186 differentially expressed genes（＞ 1.5?fold changes）were screened out by DNA microarray technology,including 128 up?regulated genes and 58 down?regulated genes.Real?time quantitative PCR showed that the mRNA expression of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9（PCSK9）and fatty acid binding protein 3（FABP3）in the propranolol group were（9.88 ± 2.19）and（21.90 ± 8.18）times that in the blank control group respectively（t=7.028,4.427 respectively,P＜ 0.05）.ConclusionsPropranolol at high concentrations can inhibit the proliferation of HemEC and HUVEC,and its inhibitory effect on HemEC is stronger than that on HUVEC.The inhibitory effect of propranolol on HemEC may be related to the inhibition of HemEC proliferation and promotion of HemEC apoptosis.

Hemangioma;Propranolol;Cell proliferation;Apoptosis;Gene expression profiling;Oligonucleotide array sequence analysis

Fund programs:Science and Technology Planning Program for Applied Basic Research of Hunan Province of China（2010FJ6001）;Natural Science Foundation of Hunan Province of China（11JJ5054）

湯建萍，Email：jpingtang@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.006

湖南省應用基礎研究科技專項計劃項目（2010FJ6001）；湖南省自然科學基金（11JJ5054）

2017?05?03）

周良佳 顏艷）