Beclin1表達(dá)水平與乳腺癌臨床分期相關(guān)性的研究

潘贇昊，顧巖，石陽，汪成*

（1. 上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院乳腺外科，上海 200002；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200011；3. 上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200002）

臨床論著

Beclin1表達(dá)水平與乳腺癌臨床分期相關(guān)性的研究

潘贇昊1，顧巖2，石陽3，汪成1*

（1. 上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院乳腺外科，上海 200002；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200011；3. 上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200002）

目的Beclin1是與自噬相關(guān)的重要基因，本研究旨在明確其表達(dá)水平與乳腺癌臨床分期的相關(guān)性。方法隨機(jī)抽取2003年-2012年在上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院手術(shù)的200例乳腺癌，20例良性乳腺疾病，對220例石蠟標(biāo)本重新取材，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測Beclin1的表達(dá)水平。結(jié)果Beclin1在乳腺癌原位癌組織中表達(dá)水平顯著高于浸潤性癌組織，乳腺癌細(xì)胞分化越差Beclin1表達(dá)水平越低。結(jié)論Beclin1檢測在乳腺癌診斷、診療中具有重要價(jià)值，可能作為預(yù)測乳腺癌病理分期的候選分子標(biāo)志物。

Beclin1；自噬；乳腺癌；病理分期

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤發(fā)病率僅次于呼吸系統(tǒng)腫瘤及消化系統(tǒng)腫瘤[1]。我國乳腺癌的發(fā)病率正逐年上升，給我國女性健康及國民經(jīng)濟(jì)帶來了嚴(yán)重的損害[2]。近年來，隨著乳腺癌診斷及治療手段的提高，患者遠(yuǎn)期生存率可達(dá)80%以上[3]。但仍有部分患者對先有檢查手段不敏感，導(dǎo)致診斷及治療的延誤。因此，需要更多的分子生物學(xué)指標(biāo)，來更精準(zhǔn)判斷乳腺癌的惡性程度、對不同治療的反應(yīng)以及遠(yuǎn)期預(yù)后。

須降解的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分，在亞細(xì)胞水平形成自噬溶酶體，進(jìn)而自我吞噬以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝和更新的過程稱為自噬。自噬對腫瘤具有雙向調(diào)節(jié)作用：適度的自噬可促進(jìn)細(xì)胞生存，而過度的自噬將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[4-6]。Beclin1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的抑癌基因，Beclin1在調(diào)節(jié)自噬活性、激活細(xì)胞程序性死亡過程中扮演著重要角色。有研究[7-9]表明Beclin1可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但也有相反的報(bào)道稱Beclin1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。目前國內(nèi)外對該基因與乳腺癌相關(guān)臨床以及病理學(xué)的研究非常匱乏，本研究通過分析Beclin1在乳腺癌組織中的表達(dá)與乳腺癌分期之間的關(guān)系，探討了Beclin1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為Beclin1檢測在乳腺癌診療過程中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 隨機(jī)抽取了2003年-2012年在上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院手術(shù)的病例220例，其中乳腺癌200例，良性乳腺疾病20例。200例乳腺癌病例中，原位癌83例，浸潤性癌117例。

1.2 免疫組化 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測Beclin1的表達(dá)，羊抗人Beclin1抗體（Abcam, ab107639），鼠抗人PR抗體（Abcam, ab107639），兔抗人ER抗體（Abcam, ab107639）。染色陽性位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，為棕黃色顆粒，染色強(qiáng)度明顯高于背景者為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。F檢驗(yàn)計(jì)量樣本的方差齊性，具有方差齊性的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，不具有方差齊性的計(jì)量資料采用z檢驗(yàn)，構(gòu)成比及率應(yīng)用卡方檢驗(yàn)、Fish確切幾率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 本研究所收集的乳腺癌病例患者一般情況詳見表1，統(tǒng)計(jì)分析了乳腺癌常見與生活相關(guān)的危險(xiǎn)因素。

表1 患者基本資料

2.2 Beclin1在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的免疫組化結(jié)果 見圖1。

2.3 Beclin1在T0-Tis、T1、T2和T3分期乳腺癌組織中陽性率的比較 T0-Tis 期與其它分期相比，Beclin1陽性率在原位癌組的陽性率顯著高于浸潤性癌組（P＜0.05），T1、T2、T3各組間Beclin1陽性率無顯著差異（P＞0.05），Beclin1陽性率在非原位癌患者中與腫瘤體積大小無關(guān)。

2.4 Beclin1在不同級(jí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中陽性率的比較 Beclin1陽性率在各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者組織標(biāo)本中的表達(dá)陽性率無顯著性差異（P＞0.05）。

研究結(jié)果顯示，Beclin1表達(dá)水平在良惡性乳腺組織中有明顯差異（P＜0.05），良性乳腺組織中的表達(dá)率為85%（n=17）；在乳腺癌中的表達(dá)率為33.5%（n=67），其中原位癌中的表達(dá)率為50.6%（n=42），浸潤性癌中的表達(dá)率為21.37%（n=25），且浸潤癌中的表達(dá)率明顯低于原位癌，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳腺癌中Beclin1陽性率與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P＜0.05），級(jí)別越高（分化越差），Beclin1陽性率越低。腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、Ki67及CerbB-2的表達(dá)與Beclin1陽性率無關(guān)（P均＞0.05）。

圖1 Beclin1免疫組化染色結(jié)果：A、B：正常乳腺組織Beclin1染色陽性及陰性結(jié)果；C、D：乳腺癌組織Beclin1染色陽性及陰性結(jié)果。

表2 Beclin1在T0-Tis、T1、T2和T3分期乳腺癌組織中陽性率的比較

表3 Beclin1在不同級(jí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中陽性率的比較

3 討論

自噬是細(xì)胞維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段，自噬功能異常可導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，甚至出現(xiàn)癌變[10]。深入了解細(xì)胞自噬功能以及腫瘤細(xì)胞自噬功能正常與否，是判斷腫瘤患者預(yù)后以及研制新型抗腫瘤藥物的基礎(chǔ)。Beclin1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的抑癌基因，Beclin1在調(diào)節(jié)自噬活性、激活細(xì)胞程序性死亡過程中扮演著重要角色[11]。

本研究從臨床病理學(xué)、腫瘤分期、分級(jí)等多方面，探討了Beclin1基因及其產(chǎn)物在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。研究結(jié)果顯示Beclin1在乳腺癌患者中的表達(dá)水平明顯下降，且乳腺癌細(xì)胞分化越差，Beclin1表達(dá)水平越低。據(jù)此推測，Beclin1在乳腺細(xì)胞發(fā)生病變開始，出現(xiàn)功能缺陷，可能是腫瘤細(xì)胞其他抑癌基因缺陷相互作用導(dǎo)致Beclin1表達(dá)異常，抑制了細(xì)胞的自噬功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖；也可能是Beclin1表達(dá)異常導(dǎo)致抑癌基因功能缺陷，從而使得細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂并出現(xiàn)惡性增殖。具體生物學(xué)通路機(jī)制，需要更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)加以佐證[12-15]。

由于標(biāo)本量有限，本研究尚未明確排除年齡、腫瘤分期、分級(jí)以及腫塊大小等相關(guān)變量后，Beclin1陰性能否成為乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為明確Beclin1表達(dá)水平減低與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系，我們須進(jìn)一步檢測乳腺癌組織中Beclin1陰性的乳腺癌患者正常乳腺組織中Beclin1的表達(dá)水平，我們將在后續(xù)的研究中，著重探討兩者間的因果關(guān)系。為詳細(xì)闡明Beclin1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，Beclin1表達(dá)水平與Ki-67不同表達(dá)區(qū)間、P53突變率、HER-2表達(dá)等之間的關(guān)系，以及Beclin1表達(dá)與否對乳腺癌患者預(yù)后的影響，我們將進(jìn)一步收集我院乳腺癌標(biāo)本，并注意收集乳腺癌患者正常乳腺組織標(biāo)本，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1表達(dá)水平在良惡性乳腺組織中的差異，分析了乳腺癌中Beclin1陽性率與腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為Beclin1檢測在乳腺癌診療過程中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果提示，Beclin1檢測在乳腺癌診斷、診療中具有重要價(jià)值，可能作為預(yù)測乳腺癌病理分期的候選分子標(biāo)志物。

[1] 陳萬青, 鄭榮壽. 中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J].中國腫瘤臨床, 2015(13): 668-674.

[2] 鄭瑩, 吳春曉, 張敏璐, 等. 乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征[J]. 中國癌癥雜志, 2013(8): 561-569.

[3] 曾佳佳, 楊潤祥, 劉蓉, 等. 乳腺癌的靶向治療研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志, 2016(1): 7-11.

[4] 焦慶麗, 吳愛國, 邵國利, 等. 乳腺癌組織Beclin1和EMT相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)及其臨床意義探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2015, 22(18): 1456-1460, 1465.

[5] 姚維深, 周國華, 張旭, 等. Bcl-2和Beclin1及PTEN在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2013,34(10): 1538-1540.

[6] 杜蕓, 李迎娟, 吳家寧, 等. 自噬基因Beclin1在細(xì)針穿刺乳腺病變中的表達(dá)及其與Bcl-2和p53的相關(guān)性[J]. 腫瘤防治研究,2013, 40(5): 459-462.

[7] Miracco C, Cosci E, Oliveri G,et al. Protein and mRNA expression of autophagy gene Beclin1 in human brain tumours [J]. Int J Oncol, 2007, 30(2): 429-436.

[8] Daniel F, Legrand A, Pessayre D,et al. Beclin 1 mRNA strongly correlates with Bcl-XLmRNA expression in human hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Invest, 2007,25(4): 226-231.

[9] Ahn CH, Jeong EG, Lee JW,et al. Expression of beclin-1,an autophagy-related protein, in gastric and colorectal cancers[J]. APMIS, 2007, 115(12): 1344-1349.

[10] 王日瑋. 自噬基因Beclin1與乳腺癌的關(guān)系[J]. 中國普通外科雜志, 2012, 21(5): 591-596.

[11] 周國華, 姚維深, 張旭, 等. Beclin1和LC3在乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2013, 24(5): 630-632.

[12] 陳波, 金鋒, 姚凡, 等. 乳腺癌中Beclin 1基因下調(diào)機(jī)制的研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 21(12): 1070-1072.

[13] Cao Y, Klionsky DJ. Physiological functions of Atg6/Beclin1: a unique autophagy-related protein [J]. Cell Res,2007, 17(10): 839-849.

[14] Furuya T, Kim M, Lipinski M,et al. Negative regulation of Vps34 by Cdk mediated phosphorylation [J]. Mol Cell,2010, 38(4): 500-511.

[15] Luo S, Rubinsztein DC. Apoptosis blocks Beclin1-dependent autophagosome synthesis:an effect rescued by Bcl-XL [J]. Cell Death Differ, 2010, 17(2): 268-277.

Correlation research between Beclin1 expression level and clinical stage of breast cancer

Yunhao PAN1, Yan GU2, Yang SHI3, Cheng WANG1*
1. Department of Breast Surgery, Huangpu District Central Hospital, Shanghai 200002, China;2. Department of General Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3. Department of Oncology, Huangpu District Central Hospital, Shanghai 200002, China

ObjectiveBeclin1 is a gene associated with autophagy, the purpose of this research is to clarify the correlation between the expression level and clinical stage of breast cancer.MethodsTotal of 200 cases of breast cancer and 20 cases of benign breast diseases were randomly selected from Central Hospital of Shanghai Huangpu District during 2003-2012 years. 220 paraffin specimens were collected and restained to detect the expression of Beclin1 using immunohistochemical staining technique.ResultsThe expression level of Beclin1 in breast cancer Primary carcinoma tissue was significantly higher than that in invasive carcinoma tissues, and the lower the differentiation of breast cancer cells, the lower the expression level of Beclin1.ConclusionThe results suggest that Beclin1 detection has critical value in the diagnosis and treatment of breast cancer, and may be used as candidate molecular marker to predict the pathological stage of breast cancer.

Beclin1; Autophagy; Breast neoplasm; Pathological staging

基金：上海市黃浦區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.(2013)HWR/Q-16）

汪成，E-mail：wangcheng1212@sina.cn