SREBP-1在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

岳朝馳 楊向東

(西南醫科大學附屬醫院肛腸科，四川 瀘州 646000)

SREBP-1在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

岳朝馳 楊向東1

(西南醫科大學附屬醫院肛腸科，四川 瀘州 646000)

目的探討固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1在結直腸癌中的表達特征及其與患者病情及預后的相關性。方法臨床收集56例結直腸癌患者腫瘤組織及相應的癌旁組織，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)及免疫組化(IHC)技術檢測組織中SREBP-1的表達，分析結直腸癌組織SREBP-1 mRNA的表達水平與患者年齡、體重、性別、腫瘤大小、臨床Dukes分期及病理學分級的相關性，比較SREBP-1陽性率與患者臨床資料間的關系，Kaplan-Meier生存分析法分析患者結直腸癌組織SREBP-1 mRNA的表達與預后的關系。結果RT-PCR結果顯示結直腸癌組織SREBP-1 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，IHC的結果示結直腸癌組織中細胞SREBP-1陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。Spearman相關性分析顯示患者結直腸癌組織SREBP-1的表達與患者年齡、性別、體重及腫瘤大小無顯著相關性(P>0.05)，與患者臨床Dukes分期及病理學分級呈顯著正相關(P<0.05)。kaplan-Meier生存分析示癌組織中高表達SREBP-1的患者預后不良。結論SREBP-1高表達于結直腸癌組織，且與腫瘤惡性程度、進展及患者不良預后密切相關，是潛在的結直腸癌標志物。

固醇調節元件結合蛋白；結直腸癌；Dukes分期；病理學分級

固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1是體內膽固醇濃度調節的關鍵分子，近年有研究顯示，其參與肝細胞癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發生發展〔1，2〕，但在結直腸癌中的作用尚不明確。本研究擬探究SREBP-1與結直腸癌患者臨床資料及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取西南醫科大學附屬醫院2013年2月至2014年9月入院的56例結直腸癌患者，均行根治性手術治療，切除的手術組織標本送至病理科進行病理診斷及免疫組化，另取部分組織標本及癌旁組織(距癌變病灶>5 cm以上)置于液氮中保存，待抽提RNA行實時熒光定量PCR(RT-PCR)實驗。其中男32例，女24例；年齡32～73〔平均(57.2±11.4)歲；體重42.0～76.0 kg，平均(62.2±8.9)kg；腫瘤原發灶最長徑≥3 cm 25例，<3 cm 31例，平均(2.79±1.68)cm；患者Dukes分期及病理學分級均以國際抗癌聯盟(UICC)和美國腫瘤聯合會(ACS)聯合制定的分期分級標準為依據〔2〕，其中Dukes A期12例，B期21例，C期17例，D期6例；根據腺管的形成比例評價患者的病理學分級：高分化結直腸癌(>95%腺管形成)23例，中分化(≥50%并≤95%腺管形成)17例，低分化(<50%腺管形成)16例。患者均為初發結直腸癌病例，未合并其他明顯的器質性疾病，且入院前未經過任何形式的相關治療。治療后的患者進行隨訪觀察2年。

1.2實驗儀器及材料 實驗儀器主要包括：PCR儀(美國Applied Biosystems)、超微量分光光度計(美國Nanodrop2000)、9700熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)、超凈工作臺(美國Bio-Rad)、快速冷卻離心機5810R(德國Eppendorf)、RM2235切片機(德國Leica Biosystems)、DM500光學顯微鏡(德國Leica Biosystems)，各規格吉爾森P型移液器(荷蘭Pipetman)，陶瓷研磨器等。實驗耗材：1.5 ml離心管、凍存管、PCR用8連管及各規格一次性移液槍槍頭(美國Axygen Brand Products)，熒光定量96孔板及熒光定量96孔板(美國Applied Biosystems)等。實驗試劑：RNAiso Plus (日本Takara)，RNA逆轉錄試劑盒(美國Fermentas)，定量PCR核酸熒光染料試劑盒(SYBR Green Supermix，美國Bio-Rad)，二甲苯、甲醇、無水乙醇、過氧化氫、氯仿及異丙醇等有機溶劑(國藥集團化學試劑有限公司)，無核酸酶水(上海生工生物公司)，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(上海基因科技股份有限公司)等，實驗抗體為抗SREBP-1抗體(ab28481，美國abcam)。

1.3實驗方法

1.3.1逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 手術取出腫瘤組織及癌旁組織送病檢，各留取20 mg組織-80℃保存，抽提RNA時在低溫無核酶的條件下在研磨器中眼科剪盡量剪碎組織并研磨至細小組織塊，研磨完成后在組織中加入1 ml RNAiso Plus，于冰上裂解5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，收集上清液置準備好的新離心管中，去除較大組織塊，加入200 μl氯仿，震蕩混勻后靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，收集上清液置準備好的新離心管中，加入1 ml異丙醇，室溫靜置10 min，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，盡量吸去上清，室溫下風干后30 μl無核酶水溶解。超微量分光光度計檢測RNA濃度，取1 μg行逆轉錄，所有反應在冰上進行操作，將混合好的反應液1以3 μl/孔加入8連管中，加無核酶水至10 μl；42℃，配置反應液2，無核酶水定容至20 μl；37℃，15 min后85℃ 5 s，得到的cDNA稀釋至500 μl。熒光實時定量PCR反應體系檢測基因表達水平。反應條件：預變性 94℃ 4 min，擴增條件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，共40個循環。SREBP-1產物大小226 bp：上游引物-GGGGACAAGGAATTCTCGGA，下游引物-TCACCACAGCTGTCAGAGAG，內參基因β-actin產物大小186 bp：上游引物-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，下游引物-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT。

1.3.2免疫組化(IHC) 將切取的組織用固定液處理24 h，之后水化切片，將石蠟切片浸于二甲苯中10 min，取出切片置于無水乙醇中5 min，再置于90%、85%、80%、75%及70%梯度酒精中各3 min。0.3%過氧化氫(H2O2)處理切片10 min，用蒸餾水沖洗3次，切片放入抗原修復液中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，蓋上壓力閥至噴汽后持續4 min。修復完成后待切片自然冷卻，蒸餾水沖洗5 min。37℃下干燥后，滴加3% H2O2于組織上，避光孵育15 min。蒸餾水沖洗5 min。滴加100 μl 1∶500 SREBP-1的一抗于組織上。室溫孵育1 h，蒸餾水沖洗5 min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100 μl IHC試劑盒中的A液于組織上，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100 μl顯色劑二氨基聯苯胺(DAB)溶液于組織上，室溫孵育10 min，二級水沖洗終止顯色。依次置于70%、75%、80%、85%、95%及100%乙醇中脫水，各3 min，脫水后浸于二甲苯中15 min，中性樹封片。IHC染色切片采用光學顯微鏡進行觀察，每張切片選取10個高倍視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計算平均陽性的細胞比例。以細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準，無陽性細胞或陽性細胞<10%的為陰性(-)，≥10%為陽性(+)。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗、Spearman秩相關檢驗和Kaplan-Meier生存分析法。

2 結 果

2.1SREBP-1在結直腸癌組織中的表達 結直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對表達量(0.185±0.010)顯著高于癌旁正常組織(0.090±0.007，t=7.57，P<0.01)。結直腸癌細胞SREBP-1陽性率為51.8%(29/56)，顯著高于癌旁正常組織的16.1%(9/56)(χ2=7.672，P<0.01)。見圖1。

圖1 結直腸癌組織與正常組織SREBP-1蛋白表達陽性率(×200)

2.2結直腸癌組織SREBP-1表達與患者一般資料的相關性 結直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對表達量與患者性別、年齡及體重均無相關性(rs=0.116、0.265、0.173，均P>0.05)。SREBP-1陽性患者與陰性患者性別、年齡及體重差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同結直腸癌組織SREBP-1蛋白表達水平患者一般資料比較〔n(%)〕

2.3結直腸癌組織SREBP-1表達水平與患者結直腸癌進展的相關性 結直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對表達量與患者腫瘤大小無相關性(rs=0.279，P>0.05)，但與臨床Dukes分期及病理分級存在相關性(rs=0.574，0.522；P<0.01)。SREBP-1陽性患者與陰性患者腫瘤大小差異無統計學意義(P>0.05)，與Dukes分期及病理學分級有統計學差異(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 不同結直腸癌組織SREBP-1蛋白表達水平患者臨床病理資料比較〔n(%)〕

2.4結直腸癌組織SREBP-1表達水平與患者預后的關系 高表達SREBP-1患者(SREBP-1 mRNA表達水平高于平均值0.185)預后水平相比低表達患者顯著不良(P<0.01)。見圖2。

圖2 結直腸癌組織SREBP-1 mRNA表達水平與患者生存時間的關系

3 討 論

SREBP-1基因位于17p11.2染色體上，其編碼的轉錄因子SREBP-1是體內關鍵的固醇調控分子，SREBP-1在細胞質中合成后進入細胞核與固醇調控元件(Sre1)結合，促進低密度脂蛋白膽固醇的形成，是脂代謝的重要組成部分〔3〕。隨著惡性腫瘤與脂代謝的密切關系〔4〕逐漸引起人們的重視，SREBP-1被發現參與多種惡性腫瘤的發生發展：Bao等〔5〕的研究發現，SREBP-1在乳腺癌組織中高表達，其表達與乳腺癌的惡性程度及病情進展均呈顯著正相關，且體外研究顯示SREBP-1可促進乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF7的增殖侵襲能力。Gibot等〔6〕發現他汀類藥物降血脂的同時可通過阻斷SREBP-1的效應，誘導胃癌細胞HGT-1的凋亡。劉洋等〔7〕發現SREBP-1在子宮內膜癌中高表達，其表達與患者年齡、臨床分期及惡性程度呈顯著正相關，且高表達SREBP-1的患者預后不良。Huang等〔8〕發現SREBP-1可通過增加活性氧(ROS)和表達NADPH氧化酶5(NOX5)誘導前列腺癌細胞氧化應激的發生，且SREBP-1表達與前列腺癌臨床Gleason等級正相關，體外實驗顯示SREBP-1參與前列腺癌細胞的增殖、侵襲及細胞耐藥。Li等〔9〕在肝細胞癌組織中也發現SREBP-1的高表達，其與患者腫瘤大小、臨床分期、組織學分級及不良預后均呈顯著正相關，其體外研究顯示SREBP-1能明顯促進肝癌細胞HepG2和MHCC97L的增殖及侵襲能力，并抑制其凋亡。Nie等〔10〕發現惡性卵巢癌中SREBP-1的陽性率顯著高于良性和交界性卵巢腫瘤，體外使用短發夾RNA(shRNA)抑制卵巢癌細胞SREBP-1的表達后發現細胞增殖侵襲能力減弱，且凋亡增加；體內裸鼠移植瘤實驗顯示抑制SREBP-1可減弱卵巢癌細胞的成瘤能力。Geng等〔11〕發現固醇酰基轉移酶(SOAT)-1可通過抑制SREBP-1抑制膠質瘤細胞的生長，Peng等〔12〕也發現SREBP-1在惡性膠質瘤細胞中高表達，且參與惡性膠質瘤的增殖。以上研究均表明SREBP-1在多種惡性腫瘤中異常表達，且與腫瘤的發生發展及腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡存在密切關系，但其在結直腸癌中的表達特性及臨床意義尚不明確。

本研究結果提示SREBP-1可能與促進結直腸癌細胞惡性行為的產生有關，SREBP-1可能通過促進結直腸癌細胞侵襲轉移能力進而促進結直腸癌淋巴結或遠處轉移，并增強結直腸癌細胞惡性轉化的程度，促進結直腸癌的發生發展，kaplan-Meier生存分析結果也進一步證實了SREBP-1在結直腸癌中的促癌效應，SREBP-1的高表達提示患者預后不良。但本研究并未明確SREBP-1與結直腸癌腫瘤大小的關系，未能為SREBP-1與結直腸癌增殖能力的關系提供線索，可能因為樣本量較少，導致統計學差異不顯著。

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R73

A

1005-9202(2017)23-5851-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.047

1 成都肛腸專科醫院肛腸科

楊向東(1961-)，男，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事肛腸疾病的中醫藥防治研究。

岳朝馳(1983-)，男，博士在讀，主治醫師，主要從事肛腸疾病的中醫藥防治研究。

〔2017-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)