糖尿病足患者外周血T細胞的分化

劉 濤 戴黎明 李曉晶 朱宏濤

(三峽大學附屬仁和醫院手足顯微外科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病足患者外周血T細胞的分化

劉 濤 戴黎明 李曉晶 朱宏濤

(三峽大學附屬仁和醫院手足顯微外科，湖北 宜昌 443000)

目的探討糖尿病足(DFU)患者外周血中T細胞分化情況及其功能。方法采用流式細胞術分析DFU患者外周血中CD4+、CD8+T細胞亞群分布情況，包括初始T細胞、活化T細胞及效應T細胞；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T細胞遷移分子CC趨化因子受體(CCR)5、CCR4、CXC趨化因子受體(CXCR)3的表達情況；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T細胞分泌炎癥因子干擾素(IFN)γ，白細胞介素(IL)2，腫瘤壞死因子(TNF)-α情況。結果與對照組比較，DFU患者外周血初始CD4+、CD8+T細胞比例顯著降低，活化與效應T細胞比例顯著升高(P<0.05)；遷移分子受體CCR4表達無顯著差異(P>0.05)，CCR5與CXCR3表達在DFU患者中顯著降低(P<0.05)；DFU患者中，炎癥因子IFNγ在活化T細胞中高表達，在效應T細胞中幾乎不表達，而IFNγ與TNF-α在效應T細胞中高表達，在初始T細胞中幾乎不表達。結論DFU患者外周血T細胞亞群發生變化，其分泌的炎癥因子影響了T細胞的免疫功能發揮。

糖尿病足；CD4+T細胞；CD8+T細胞；炎癥

糖尿病足(DFU)引起的損傷與多種因素相關，包括神經損傷、微血管病變及免疫功能受損等〔1，2〕。目前治療方法主要依賴于下肢截肢，加上一些治療效果非常有限的新方法〔3〕。高血糖可以激活核轉錄因子(NF)-κB，從而破壞淋巴細胞激活與遷移〔4〕。相反，促炎因子如白細胞介素(IL)6，腫瘤壞死因子(TNF)-α被發現在DFU患者中加重胰島素耐受〔5〕。盡管在DFU患者中發現有慢性炎癥，然而DFU的免疫系統無法正常驅動有效的免疫應答，對抗病菌侵害與組織再生〔6〕。研究發現，DFU的創面難愈不僅由于體內有過量的促炎因子，并且還與抗感染因子的缺陷相關，如轉化生長因子(TGF)-β，IL10等〔7〕。而在炎癥與病菌耐受的平衡調控中，T細胞發揮重要的作用。在動物模型中發現，CD4+T細胞敲除對傷口愈合有負面影響，而CD8+T細胞的敲除有積極影響〔8〕。在DFU患者中，趨化環境與免疫細胞遷移的能力都發生了變化〔9〕，T細胞對于維持系統促炎環境有重要作用〔10〕。本文探究DFU患者免疫系統對傷口愈合的精確調控機制及外周血T細胞亞群的分布情況。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取三峽大學附屬仁和醫院2016年2～10月就診的DFU患者52例，男28例，女24例，年齡35～78(平均54)歲，自愿參加本研究，研究前均未接受放射性治療、化療或其他治療。年齡相匹配健康正常人為對照組48例，男25例，女23例，平均52歲。均獲得受試者的書面同意書，經醫院倫理委員會批準。儀器與試劑：細胞培養基〔RPMI，10%胎牛血清(FBS)，55 μmol/L 2-硫基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 μg/ml谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素〕;流式分析儀器：BD公司的Calibure。流式熒光抗體均購自Biolegend公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞提取 取受試者25 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)梯度離心。

1.2.2流式細胞術分析樣品的制備

1.2.2.1細胞刺激 將分離得到的細胞重懸在1 ml細胞培養基中，加入25 ng/ml佛波酯(PMA)和1 μg/ml離子霉素，37℃細胞培養箱中刺激5 h后收集細胞分析。

1.2.2.2流式抗體標記 將細胞重懸在100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細胞標3 μl流式抗體。置于4℃冰箱中避光孵育30 min，用1 ml PBS洗2次。后加入200 μl PBS上流式儀器分析。

1.3觀察指標 (1)分析兩組外周血中初始T細胞、活化T細胞、效應T細胞。(2)分析特異的皮膚遷移分子CC趨化因子受體(CCR)4的表達及早期炎癥性Th1細胞特異的分子CCR5和CXC趨化因子受體(CXCR)3的表達情況。(3)分析T細胞亞群中主要的炎癥性因子IL2，IFNγ，TNF-α表達情況。

1.4統計學方法 應用Graph Pad Prism 5.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血中初始、活化與效應T細胞比較 DFU患者外周血中初始CD4+T細胞〔(19.8±2.2)%〕、CD8+T細胞〔(11.9±1.3)%〕比例顯著低于對照組〔(42.3±5.5)%、(21.5±2.4)%,P<0.01〕?；罨疌D4+T細胞的比值〔(53.8±5.7)%〕顯著高于對照組〔(18.4±2.1)%，P<0.05〕，CD8+T細胞〔(22.1±1.3)%、(21.7±1.8)%〕比較無統計學差異(P>0.05)。DFU患者效應CD4、CD8T細胞比例〔(18.6±1.8)%、(38.9±2.5)%〕顯著高于對照組〔(8.4±1.2)%、(20.4±2.7)%，P<0.05〕。

2.2DFU患者T細胞趨化因子受體表達 CCR4主要表達于活化T細胞中，在CD4+T細胞中表達水平更高。兩組CCR4表達無統計學差異(P>0.05)。CCR5與CXCR3主要表達在活化T細胞與效應T細胞中。DFU患者CCR5與CXCR3在CD4+與CD8+的效應T細胞中表達顯著低于對照組(P<0.05)。見圖1。

與DFU組比較：1)P<0.05圖1 DFU患者T細胞趨化因子受體表達

2.3DFU患者外周血T細胞炎癥因子分泌的變化 CD4+與CD8+中活化T細胞分泌的IL2〔(62.1±3.4)%、(54.6±2.7)%〕顯著多于初始T細胞〔(40.2±2.9)%、(21.6±1.3)%，P<0.01〕。IFNγ與TNF-α在活化細胞與效應細胞中均高表達，且效應細胞中IFNγ〔(82.8±4.1)%、(81.7±4.6)%〕與TNF-α〔(82.3±6.1)%、(80.7±4.3)%〕表達均顯著高于活化細胞〔(43.1±3.8)%、(56.2±4.3)%，(63.1±5.8)%、(59.2±3.3)%，P<0.01〕。

3 討 論

早期有研究揭示了T細胞在創傷修復中炎癥與增殖的雙重作用，盡管創傷修復的損傷通常認為與CD8+T細胞的作用相關，然而關于T細胞亞群在創傷修復中的具體作用還有待被闡明〔11〕。本研究結果發現，DFU患者體內存在的促炎環境導致了初始T細胞亞群的顯著性減少，同時伴隨著不同階段活化T細胞的積累。一些DFU患者在沒有出現足部潰瘍時，就已經出現了效應T細胞比例與數目的顯著性增加。說明效應T細胞的積累是DFU患者中一個持續性的現象。

本研究結果發現，DFU患者中積累的效應T細胞，是炎癥性因子IFNγ與TNF-α的主要來源，這些細胞因子反過來增強初始T細胞的激活與分化〔12〕。而且，活化T細胞通過產生低水平的IFN-γ與TNF-α也對系統性炎癥環境的形成有作用。研究發現，在動物模型中，體內抑制TNF-α可以顯著促進傷口愈合〔13〕。本研究結果提示，DFU患者持續積累的CD4+與CD8+效應T細胞可能與異常高表達INF-γ與TNF-α相關，可能導致了炎癥性受體表達的下降，從而影響了T細胞遷移到發炎的組織中去。在免疫治療策略上，可以通過降低T細胞活化與T細胞在組織中的積累降低DFU的病理性。

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R587.2

A

1005-9202(2017)23-5839-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.041

戴黎明(1975-)，男，副主任醫師，主要從事手足創傷修復、整形美容研究。

劉 濤(1979-)，男，主治醫師，主要從事骨科研究。

〔2017-05-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)