動脈粥樣硬化患者血清miR-520b表達水平及相關機制

王 昆 郭靖濤 張金艷 周 江

(承德市中心醫院心血管內科，河北 承德 067000)

心、腦血管及代謝性疾病·

動脈粥樣硬化患者血清miR-520b表達水平及相關機制

王 昆 郭靖濤 張金艷 周 江

(承德市中心醫院心血管內科，河北 承德 067000)

目的探討動脈粥樣硬化患者血清miR-520b表達水平及相關作用機制。方法選取該院收治的動脈粥樣硬化患者42例，收集同期42名健康老年人為對照。qRT-PCR檢測外周血清miR-520b表達水平。經targetscan和miRanda數據庫預測importin 8(IPO8)為miR-520b的可能靶基因，通過雙熒光素酶報告基因檢測證實；體外細胞實驗采用Western印跡檢測miR-520b對人血管內皮細胞IPO8表達的影響；CCK-8法和Tranwells實驗檢測miR-520b對人血管平滑肌細胞增殖、遷移能力的影響。結果動脈粥樣硬化患者血清miR-520b相對表達量低于健康老年人(P<0.05)。雙熒光素酶報告基因檢測證實IPO8是miR-520b的直接作用靶基因；轉染miR-520b類似物人血管內皮細胞IPO8蛋白相對表達量低于類似物陰性對照組(P<0.05)；轉染特異性miR-520b抑制物后，血管內皮細胞中IPO8蛋白相對表達量高于抑制物對照組(P<0.05)。提升miR-520b表達后人血管平滑肌細胞增殖和遷徙能力均低于相應陰性對照(P<0.05)；抑制miR-520b表達后人血管平滑肌細胞增殖和遷徙能力均高于相應陰性對照，差異有統計學意義(P<0.05)。結論動脈粥樣硬化患者血清miR-520b表達水平明顯降低；miR-520b可通過阻斷NF-κB信號通路及抑制血管平滑肌細胞增殖、遷徙來發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化；miR-520b；NF-κB通路；細胞增殖、細胞遷移

動脈粥樣硬化是一個復雜的慢性病變過程，涉及血液成分、動脈壁細胞、胞外基質、遺傳和環境等多種因素的相互作用〔1〕。血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖、巨噬細胞炎性介質釋放是動脈粥樣硬化的3個重要過程，其中NF-κB途徑是介導血管內皮細胞損傷，炎性介質釋放的重要信號通路，而importin(IPO)家族是NF-κB核內移的關鍵轉運蛋白〔2〕。miRNA參與一系列內源性分子調控過程，相關研究顯示，miRNA在動脈粥樣硬化發生、發展過程中發揮重要調控作用〔3〕，miR-520b參與調控大鼠血管內皮細胞激活和炎癥反應〔4〕，推測其與動脈粥樣硬化形成相關，但基于臨床患者的研究仍鮮有報道。本次研究選取42例動脈粥樣硬化患者，檢測血清miR-520b的表達情況，并探討miR-520b對人血管內皮細胞中靶基因IPO8表達及人血管平滑肌細胞增殖、遷徙能力的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2016年10月間承德市中心醫院收治的動脈粥樣硬化患者42例。患者血脂明顯升高，外周血管彩色多普勒超聲診斷為Ⅱ～Ⅲ級動脈粥樣硬化，簽署知情同意書。其中男31例，女11例，年齡62～88歲，平均(77.25±9.61)歲。收集同期42例健康老年人，其中男性29例，女性13例，年齡60～89歲，平均(76.19±11.24)歲。兩組受試者性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理 采集兩組受試者外周血10 ml，4 000 r/min離心20 min，收集上層血清，4℃保存。人血管平滑肌細胞和內皮細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司，放入含10%胎牛血清的DMEM培養基中常規傳代培養。

1.2.2qRT-PCR檢測血清中miR-520b表達水平 取血清2 ml，Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。miR-520b莖環結構逆轉錄引物和RCR擴增上下游引物均由生工生物(上海)有限公司合成。反應體系20 μl，反應條件：92℃ 10 min；95℃ 30 s，共40個循環；55℃ 1 min；4℃維持。Run6b為內參，計算miR-520b相對表達量。

1.2.3細胞轉染 取對數期人血管平滑肌細胞按1×106/孔的密度接種于6孔板中，常規培養24 h，細胞密度>50%后進行傳染。miR-520b類似物、抑制劑和對應的陰性對照均由生工生物(上海)有限公司合成。進行細胞瞬時轉染，6孔板中每孔細胞轉染13 μl miR-520b抑制劑或8 μl miR-520b類似物，培養48 h后收集細胞行Western印跡檢測。按1×104/孔密度將細胞接種于96孔板中，試劑用量為6孔板的10%，轉染方法同上，用于細胞增殖實驗。FAM熒光對照和定量PCR檢測轉染效率；人內皮細胞轉染方法同人血管平滑肌細胞。

1.2.4miR-520b靶基因預測和雙熒光素酶檢測 使用targetscan和miRanda數據庫預測miR-520b可能靶基因，選取IPO8作為本次研究的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測使用的螢火蟲熒光素酶載體(pgl4.10質粒)和海腎熒光素酶載體(pRL-Null質粒)由上海遠慕生物科技有限公司提供。目的基因IPO8的DNA片段由生工生物(上海)有限公司合成。構建重組質粒，經轉化、擴增后行雙熒光素酶報告基因檢測，以CHO細胞作為工具細胞轉染，分為4組：①空白對照組：轉染pgl4.10空載體+pRL-Null空載體；②陰性對照組：轉染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重組質粒+類似物陰性對照+pRL-Null載體；③實驗組：轉染pgl4.10-miR-IPO8-3′UTR重組質粒+miR-520b類似物+ pRL-Null載體；④突變體組：轉染pgl4.10-miR-IPO8-mutant-3′UTR重組質粒+ miR-520b類似物+ pRL-Null載體。檢測熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值。

1.2.5Western印跡檢測IPO8表達水平 人內皮細胞按1×106/孔的密度接種于6孔板中，轉染miR-520b類似物、抗miR-520b抑制物和陰性對照，培養72 h后收集細胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳、轉膜，加一抗(IPO8多克隆抗體，1∶1 000)、二抗，電化學發光(ECL)顯色后掃描拍照，計算灰度值。

1.2.6細胞計數和遷徙實驗 采用CCK-8法檢測人血管平滑肌細胞增殖能力，試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，操作按說明書進行，酶標儀讀取450nm波長出吸光度值。Tranwells實驗檢測miR-520b對人血管平滑肌細胞遷移能力的影響。將小室放入24孔板中，細胞按1×106/孔的密度接種到上室、下室，分別加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培養液，孵育24 h后小室膜上細胞用乙醇固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察侵襲細胞。

1.3統計學分析 使用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1患者血清中miR-520b表達水平 動脈粥樣硬化患者血清miR-520b相對表達量為32.75±1.18，低于健康老年人的83.39±6.82，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2驗證IPO8是miR-520b的靶基因 實驗組通過共轉染克隆IPO8 mRNA-3′UTR片段的螢火蟲熒光素酶載體、海腎熒光素酶載體和miR-520b類似物的熒光素蛋白相對表達量分別為17.13±0.58、25.06±0.74、29.31±4.43，低于空白對照組和陰性對照組的59.37±2.61、54.01±5.54，差異有統計學意義(P<0.01)。突變體組熒光素蛋白相對表達量為28.68±3.35，高于實驗組的17.13±0.48，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3轉染miR-520b類似物、抑制物對人血管內皮細胞IPO8表達的影響 轉染miR-520b類似物人血管內皮細胞IPO8蛋白相對表達量為0.39±0.07，低于類似物陰性對照組的0.92±0.16，差異有統計學意義(P<0.05)；轉染特異性miR-520b抑制物后，血管內皮細胞中IPO8蛋白相對表達量為0.71±0.13，高于抑制物對照組的0.35±0.16，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.4miR-520b對人血管平滑肌細胞增殖的影響 小RNA轉染人血管平滑肌細胞，提升miR-520b表達后CCK8法檢測細胞增殖吸光度均值為1.68±0.29，低于相應陰性對照的2.77±0.25，差異有統計學意義(P<0.05)；抑制miR-520b表達后吸光度值為2.97±0.15，高于相應陰性對照的1.91±0.09，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5miR-520b對人血管平滑肌細胞遷徙的影響 提升miR-520b表達后人血管平滑肌細胞遷徙能力為8.65±0.93，低于相應陰性對照的19.75±1.28，差異有統計學意義(P<0.01)；抑制miR-520b表達后人血管平滑肌細胞遷徙能力為14.31±1.47，高于相應陰性對照的8.63±1.40，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

1為miR-520b抑制物組；2為抑制物陰性對照組；3為類似物陰性對照組；4為miR-520b類似物組；5為空白對照組圖1 miR-520b對人血管內皮細胞中IPO8蛋白表達的影響

圖2 Tranwells實驗檢測miR-520b對人血管平滑肌細胞遷徙能力的影響(×200)

3 討 論

動脈粥樣硬化是常見的心血管系統病變，也是多種心腦血管病的病理基礎。有研究顯示，miRNA在動脈粥樣硬化進展中發揮重要調控作用，如人動脈內皮細胞中，miR-155表達上調可降低氮氧化物合酶的分泌量和活性，引發細胞功能障礙〔5〕；而miR-125表達上調和miR-126表達下調會增加內皮細胞炎性蛋白分泌量〔6〕。近期研究顯示，miR-520家族廣泛參與炎癥、再生障礙性貧血、腫瘤等病理生理過程〔7〕，但尚缺少在動脈粥樣硬化過程中的作用研究。

本次研究顯示，動脈粥樣硬化患者血清miR-520b表達水平明顯低于健康老年人；進一步靶基因篩查得到IPO8是miR-520b可能的作用靶基因，IPO家族是NF-κB核內移的關鍵轉運蛋白，而核內移是NF-κB信號通路激活的必需步驟，該信號途徑已被證實為血管內皮細胞相關炎癥反應的一個重要途徑。以此為基礎本次研究將IPO8作為進一步研究的靶基因，并通過雙熒光素酶檢測證實其是miR-520b可通過調控IPO8的表達水平來抑制NF-κB信號通路激活，進而降低血管內皮細胞炎癥反應。內皮細胞炎癥激活會促進炎性因子、纖維生長因子等釋放，進而刺激血管平滑肌細胞向合成型轉換，引發血管中層平滑肌細胞向受損內膜的增殖、遷徙，引發血管內膜厚度增加、纖維化、斑塊形成、閉塞。本次研究顯示進一步證實了miR-520b過表達會抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷徙，對抗動脈粥樣硬化。相關研究顯示，阻斷血管平滑肌細胞中IPO介導的NF-κB核內移，可抑制炎癥反應〔8〕，但目前未見關于miR-520b能否影響人血管平滑肌細胞中IPO表達的報道，需深入研究。

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2顏 暉.MicroRNAs在動脈粥樣硬化中的初探〔D〕.武漢：華中科技大學，2012.

3邱明濤.動脈粥樣硬化microRNA表達譜的研究〔D〕.福州：福建醫科大學，2014.

4何少林.Treg/microRNA-181b對血管內皮細胞損傷的保護作用及機制〔D〕.武漢：華中科技大學，2013.

5李春穎，李繼成，申祥鳳，等.茶多酚對大鼠動脈粥樣硬化防治作用研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；15(4)：468-71.

6康桂蘭，景增秀.老年急性動脈粥樣硬化性腦血栓患者外周血同型半胱氨酸的變化及意義〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(13)：3182-3.

7孟 盈，徐 榮，王迎春，等.頸動脈粥樣硬化斑塊超聲造影方法學比較的初步探討〔J〕.中國衛生工程學，2016；15(6)：608-11.

8李永輝.miR-29a在動脈粥樣硬化發生發展中的作用及其分子機制〔D〕.石家莊：河北醫科大學，2013.

R541.4

A

1005-9202(2017)23-5801-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.022

河北省科學技術廳項目(20143217)

郭靖濤(1964-)，男，博士，主任醫師，主要從事冠心病及心律失常介入診療及高血壓、心力衰竭的防治等研究。

王 昆(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事冠心病診療及高血壓、心力衰竭、心律失常的防治等研究。

〔2017-09-10修回〕

(編輯 袁左鳴)