AMP依賴的蛋白激酶及PI3K/Akt信號(hào)途徑在頸動(dòng)脈狹窄形成過(guò)程中的變化

肖 穎 陳 實(shí) 余文珍 張永亮 劉盛澤

(廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院病理科，福建 福州 350007)

AMP依賴的蛋白激酶及PI3K/Akt信號(hào)途徑在頸動(dòng)脈狹窄形成過(guò)程中的變化

肖 穎 陳 實(shí)1余文珍2張永亮1劉盛澤1

(廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院病理科，福建 福州 350007)

目的觀察AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)及PI3K/Akt信號(hào)途徑在頸動(dòng)脈狹窄形成過(guò)程中的變化。方法取SD大鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)1個(gè)月后行頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)作為模型組(n=24)，繼續(xù)喂養(yǎng)14 d 后取損傷側(cè)頸總動(dòng)脈，行HE染色觀測(cè)血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)膜增生情況，應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)AMPK及PI3K/Akt mRNA水平，用Western印跡檢測(cè)p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白水平，另取8只正常SD大鼠作為假手術(shù)組。結(jié)果模型組大鼠血管內(nèi)膜增生明顯、管壁變厚；AMPK/PI3K/Akt mRNA及蛋白水平較假手術(shù)組顯著下降(P<0.01)。結(jié)論AMPK/PI3K/Akt在頸動(dòng)脈狹窄的病理生理進(jìn)程中起到一定的作用。

頸動(dòng)脈狹窄；AMP依賴的蛋白激酶；PI3K；Akt

頸動(dòng)脈狹窄是導(dǎo)致缺血性腦血管病的重要原因之一，可引起腦卒中等疾病并導(dǎo)致相應(yīng)的臨床癥狀。頸動(dòng)脈狹窄的形成機(jī)制比較復(fù)雜，頸動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊的形成及血管內(nèi)膜的損傷是其發(fā)生的重要病因〔1〕。有報(bào)道AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)參與了缺血后血管重建，AMPK是細(xì)胞的能量變化感受器，參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路等。本文擬通過(guò)建立頸動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型，探討AMPK/PI3K/Akt途徑在頸動(dòng)脈狹窄形成過(guò)程中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，平均體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2007-0005。

1.2儀器與試劑 手術(shù)顯微鏡，美國(guó)World precision instruments；PCR儀，ABI 7500型；PCR引物，生工生物工程(上海)有限公司合成；p-AMPK、PI3K、p-Akt抗體，CST；二喹啉酸(BCA)蛋白試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司。

1.3分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組8只，無(wú)高脂喂養(yǎng)，僅切開(kāi)頸部皮膚分離基層無(wú)球囊損傷，模型組24只。模型組大鼠予高脂飼料，自制配方:25%豬油,2%膽固醇,0.1%膽酸鈉，72.9%基礎(chǔ)飼料，喂養(yǎng)1個(gè)月，行頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，術(shù)后在水瓶中加入芐星青霉素以通過(guò)飲水預(yù)防感染，并單籠喂養(yǎng)。全程觀察大鼠的精神面貌、飲食及體重變化。14 d后禁食不禁水處死大鼠，取術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈段，生理鹽水洗凈，取部分(假手術(shù)組2只，模型組8只)頸總動(dòng)脈段放入10%中性甲醛中固定，余下頸動(dòng)脈段取出后迅速置于液氮中再轉(zhuǎn)存-70℃?zhèn)溆谩４笫箢i動(dòng)脈球囊損傷模型制備參照文獻(xiàn)等〔2〕方法稍進(jìn)行改良，禁食12 h，麻醉后取左斜切位，在手術(shù)顯微鏡下分離血管直至頸總動(dòng)脈分叉，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端下留線結(jié)扎，頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾住，將球囊導(dǎo)管從頸外動(dòng)脈近心端插入至頸總動(dòng)脈起始部。注入約0.1 ml 生理鹽水使球囊充盈，然后緩慢來(lái)回推拉球囊導(dǎo)管以損傷頸動(dòng)脈血管內(nèi)皮。

1.4血管內(nèi)膜病理形態(tài)學(xué)觀察 常規(guī)石蠟包埋切片后，行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮損傷程度、管壁厚度、內(nèi)膜增生等情況。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織AMPK、PI3K、Akt mRNA的表達(dá) 按Trizol法提取各組大鼠頸動(dòng)脈總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行cDNA合成。擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min變性，95℃，10 s，60℃，30 s，70℃，30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，獲得各樣本待測(cè)基因的CT值，各組間相對(duì)基因表達(dá)用2-△△CT表示。采用ACTB作為內(nèi)參照，引物序列：ACTB正義鏈5′：CTGCGGGTATCCATGAGA3′,反義鏈5′:TACCACCACTGAGAACGATG3′;AMPK-G8正義鏈5′：ATGTCCTGCTTGATGCACAC3′；反義鏈5′CTTCTGGTGCAGCATAGTTG3′;PI3K-G9正義鏈5′：TTTGGATAACTTGCTTGTGAGATT3′；反義鏈5′CGACTTGCCTATTCAGGTGCTT3′；Akt-G10正義鏈5′：GCTTCTTTGCCGGTATCGTGT3′；反義鏈5′GCTGTCATCTTGGTCAGGTGGT3′。

1.6Western印跡法檢測(cè)組織p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá) 將組織加入蛋白裂解液冰浴條件下勻漿，并按BCA法進(jìn)行蛋白定量。配十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳膠，后將蛋白樣品用此凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含5% 脫脂奶粉封閉液室溫輕搖漂洗PVDF 膜1 h，將膜放入大小適宜的自封袋中，分別加入1∶(500～1 000)稀釋一抗37℃1 h，取出PVDF膜，用T-TBS 液洗3次，每次10 min，后加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗。室溫2 h，取出PVDF膜，用T-TBS 液洗3次，每次10 min，用電光學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，曝光顯影。以β-actin蛋白為內(nèi)參照，計(jì)算各組p-AMPK、PI3K、p-AKT的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況觀察 假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)有明顯異常改變。模型組大鼠術(shù)后前3 d大鼠精神較差，后稍有好轉(zhuǎn)，但毛發(fā)欠光澤，體重增長(zhǎng)緩慢，未見(jiàn)感染死亡現(xiàn)象。

2.2各組損傷側(cè)頸動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組血管壁完整，內(nèi)、外彈力板完整連續(xù)，內(nèi)膜光滑，中膜未見(jiàn)增厚；模型組頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜明顯不規(guī)則增生，增生的細(xì)胞核大、胞質(zhì)豐富，類似平滑肌細(xì)胞，中膜增厚較明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組頸動(dòng)脈病理變化(HE，×400)

2.3各組頸動(dòng)脈AMPK、PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組AMPK、PI3K、Akt mRNA水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組AMPK、PI3K、Akt mRNA相對(duì)表達(dá)比較

2.4各組頸動(dòng)脈p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較 模型組頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達(dá)

表2 各組p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達(dá)比較

3 討 論

AMPK是一種細(xì)胞能量感受器，其激活可以調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及腫瘤浸潤(rùn)等；最近研究表明其在血管重建中也起到了重要的作用〔3,4〕。AMPK激活后可以通過(guò)AMPK-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)-一氧化氮(NO)信號(hào)途徑影響血管功能。內(nèi)皮源性NO是血管生物學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵分子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、降低血管張力和內(nèi)皮細(xì)胞黏附〔5〕。研究表明AMPK的活化可以維持正常血管結(jié)構(gòu)，AMPK失活和血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)，其表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)膜病變，且與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病相關(guān)〔6〕；而當(dāng)其激活后可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附減少，脂質(zhì)積累減少，防止脂質(zhì)氧化引起的炎癥擴(kuò)散，刺激負(fù)責(zé)細(xì)胞抗氧化防御基因的表達(dá)，促進(jìn)NO的形成，并認(rèn)為AMPK是血管內(nèi)膜增生和再狹窄的治療目標(biāo)〔7，8〕。Ki等〔9〕對(duì)用AMPK激動(dòng)劑對(duì)PDGF誘導(dǎo)血管內(nèi)膜細(xì)胞增生AMPK可以抑制血管內(nèi)膜的增生。通過(guò)激活A(yù)MPK可以有效地抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖〔8〕。AMPK也可以通過(guò)mTOR、p53、PI3K三條通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)膜〔10〕。

PI3K/Akt信號(hào)通路也參與細(xì)胞增殖與分化、凋亡等多種生理和病理過(guò)程。研究表明PI3K激動(dòng)劑能夠通過(guò)提高Akt 和eNOS的磷酸化水平從而有效地激活 PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑，而PI3K的抑制劑則抑制eNOS的活性；并且PI3K/Akt信號(hào)通路能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化中起到重要的作用，其主要通過(guò)激活eNOS發(fā)揮作用〔11～13〕。PI3K/Akt也能作用于血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)從而調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡。PI3K/Ak與AMPK相互之間存在廣泛的調(diào)整作用，兩者之間主要表現(xiàn)為相互協(xié)同合作而不是相互拮抗〔14〕。研究表明AMPK通過(guò)復(fù)雜的方式調(diào)控PI3K 信號(hào)通路，刺激該信號(hào)通路的活化，同樣AKt也能反饋調(diào)整AMPK的磷酸化過(guò)程〔15〕。AMPK和PI3K/AKt均能通過(guò)激活eNOS從而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖。有研究顯示AMPK和PI3K/AKt在前列腺癌的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，這兩個(gè)信號(hào)通路相互作用對(duì)前列腺癌生長(zhǎng)發(fā)生作用〔16〕。AMPK和PI3K/AKt信號(hào)途徑對(duì)缺血預(yù)處理的心肌細(xì)胞有協(xié)同保護(hù)作用，但是它們之間的具體關(guān)聯(lián)機(jī)制有待進(jìn)一步明確〔17〕。頸動(dòng)脈再狹窄形成過(guò)程中兩者之間可能相互作用，共同影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化。

本研究顯示在頸動(dòng)脈狹窄的形成過(guò)程中，AMPK/PI3K/AKt表現(xiàn)失活，可能與動(dòng)脈內(nèi)膜的增生、血管狹窄形成有關(guān)。進(jìn)一步明確這些信號(hào)通路在頸動(dòng)脈狹窄形成過(guò)程的機(jī)制及相互作用機(jī)制及如何通過(guò)調(diào)整這些信號(hào)通路對(duì)于有效預(yù)防頸動(dòng)脈內(nèi)膜狹窄有著積極的意義。

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R543.4

A

1005-9202(2017)23-5794-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.019

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012-S-155-1)

1 廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院神經(jīng)外科

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院

陳 實(shí)(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

肖 穎(1970-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事臨床病理學(xué)研究。

〔2016-10-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)