吉非替尼誘導p27核轉位并激活半胱天冬酶8促進NSCLC細胞凋亡的機制

楊 暢 馮 燕 王新衛 劉新年

(湖北省第三人民醫院呼吸內科，湖北 武漢 430033)

吉非替尼誘導p27核轉位并激活半胱天冬酶8促進NSCLC細胞凋亡的機制

楊 暢 馮 燕1王新衛 劉新年

(湖北省第三人民醫院呼吸內科，湖北 武漢 430033)

目的探討吉非替尼誘導的p27蛋白表達改變和核轉位及半胱天冬酶(Caspase)8的激活對表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細胞肺癌(NSCLC)細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響及作用機制。方法選取存在19號外顯子缺失突變的對吉非替尼敏感的NSCLC細胞系HCC827，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法和流式細胞術分別檢測吉非替尼在不同濃度和時間下對細胞活性的影響。利用Western印跡檢測p27蛋白和Caspase及其他相關蛋白的相對含量。通過免疫熒光法觀察p27蛋白的亞細胞定位。采用蛋白免疫共沉淀驗證p27蛋白和Caspase8之間的相互作用。結果吉非替尼濃度-時間依賴性促進了HCC827細胞凋亡。當吉非替尼干預18 h后，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子p27蛋白表達開始出現顯著升高(P<0.05)，且p27蛋白在此過程中伴隨從細胞核到細胞質的核轉位現象，而促凋亡蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關x蛋白(Bax)和Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)在吉非替尼干預后表達并未發生顯著改變。此外，細胞質中p27蛋白與Caspase8的降解中間體p43/p41結合從而抑制其自身細胞質向細胞核易位。結論推斷吉非替尼通過調節p27蛋白的亞細胞定位及Caspase8之間的相互作用，從而達到促EGFR突變的NSCLC細胞凋亡的效果。

吉非替尼；表皮生長因子受體；p27蛋白；半胱天冬酶8；凋亡；非小細胞肺癌

吉非替尼是一種可逆的、高選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，能與三磷酸腺苷競爭性結合表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶活性區，從而抑制EGFR自身磷酸化并阻斷其下游信號級聯放大〔1，2〕。非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系HCC827廣泛存在19號外顯子缺失和21號外顯子點突變，已知這種激活突變能增強細胞對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的敏感性〔3〕。吉非替尼對EGFR突變的NSCLC細胞可產生顯著的促凋亡效果〔4〕，抑制NSCLC細胞的EGFR激酶活性能夠促進細胞凋亡并將細胞周期抑制在G1期〔5〕。細胞周期進展受到細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)的調控，而且細胞從G1期進入S期受到負性細胞周期調控因子——CDK抑制因子家族的調控。p27蛋白是主要靶向細胞周期蛋白E/CDK2復合體的CDK抑制因子。抑制CDK2活性可以將周期蛋白E/CDK2驅動的G1期向S期進展阻滯。此外，應用EGFR抑制劑干預后，腫瘤細胞中CDK抑制因子p27蛋白的表達水平顯著升高〔6〕。細胞質p27蛋白在凋亡過程中與半胱天冬酶(Caspase)8裂解中間體p43/p41結合，可能是p27蛋白促細胞凋亡的關鍵〔7〕。本研究旨在探討吉非替尼誘導的p27蛋白表達改變和核轉位及Caspase8的激活對EGFR突變的NSCLC細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞培養 HCC827細胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞庫。細胞培養于含有10%胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)和1%鏈霉素青霉素(北京索萊寶科技有限公司)的杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)高糖培養基(美國HyClone公司)，置于37℃，5% CO2培養箱(美國Thermo公司371型)培養。

1.2試劑 吉非替尼原料藥，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司；膜聯蛋白(V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；高靈敏度化學發光(eECL)檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；抗Caspase8、9小鼠單克隆抗體，抗Caspase3兔多克隆抗體，抗p-EGFR和抗磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔多克隆抗體均購于英國Abcam公司；抗p27和抗p21蛋白兔多克隆抗體，抗β-Actin兔多克隆抗體，抗(GAPDH)及抗核纖層蛋白(Lamin)B兔多克隆抗體購于美國ABGENT公司。抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、抗Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)、抗Bcl相關x蛋白(Bax)及抗Bad兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的抗兔和抗小鼠抗體購于美國BD公司；蛋白免疫共沉淀(蛋白A樹脂)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)；亞細胞結構NE-PER 胞質和核蛋白抽提試劑盒(美國pierce公司)。

1.3細胞活力試驗 采用MTT法檢測細胞增殖和活力。取處于對數生長期的HCC827細胞，用血球計數板計數，用DMEM完全培養基將其稀釋成1×104個/ml鋪于96孔板，每孔100 μl。加入不同濃度(0.00、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 μmol/L)的吉非替尼處理72 h后，將MTT溶液加入使終濃度達到0.5 mg/ml，37℃培養4 h。棄去培養基后，每孔加入50 μl二甲基亞砜。利用590 nm波長酶標儀(美國Bio-rad公司imark型)檢測每孔光密度值。不同濃度加藥組與對照組吸光度的比值作為各組細胞相對活力，代表細胞死亡情況。

1.4流式細胞術 分別收集1 μmol/L吉非替尼處理不同時間(0、3、6、12、18、24 h)的HCC827細胞，細胞計數板計數，每組約1×106個細胞。洗滌，與Annexin V-FITC結合，冰浴30 min，隨后加入1 μg/ml碘化丙啶(PI)，置暗處10 min后采用流式細胞儀(美國BD公司FACSCalibur型)上機檢測。Annexin V-FITC對凋亡細胞翻轉到細胞膜外側的磷脂酰絲氨酸具有較高親和力，DNA染料PI進入凋亡細胞結合其DNA。根據二者所發熒光，儀器會自動分析出各組細胞的凋亡率。

1.5Western印跡 利用放射免疫沉淀法(RIPA)將細胞裂解進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后將裂解蛋白電轉于硝酸纖維素膜。將此膜用含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(T-PBS)室溫封閉1 h，然后將一抗用T-PBS混合液以1∶1 000稀釋比例4℃孵育過夜。待將硝酸纖維素膜用T-PBS沖洗3遍后用含辣根過氧化物酶標的1∶2 000稀釋倍數的相應二抗室溫孵育1 h。再次將硝酸纖維素膜洗滌數次后，滴加eECL化學發光試劑并進行暗室曝光。條帶的灰度值用 Image J軟件檢測分析。

1.6免疫熒光分析 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗后，將其置于含2%多聚甲醛的PBS 37℃下固定20 min。采用含0.2% Triton X-100的PBS室溫通透30 min后，將細胞用PBS沖洗3次后于37℃進行一抗(抗p27，抗Caspase8)孵育1 h，一抗用PBS混合液(3%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20，0.08%疊氮化鈉)稀釋至1∶100的比例。細胞沖洗3次，每次5 min。細胞用1∶400稀釋的共軛有FITC或德克薩斯紅(Texas Red)的二抗于37℃下孵育30 min。將玻片置于含0.1 μg/ml Hoechst H33342熒光染料的PBS中浸泡。沖洗2遍后，細胞用共聚焦顯微鏡(德國NanoFocus公司μsurf explorer型)進行直接觀察。

1.7蛋白免疫共沉淀 利用細胞質提取液進行免疫沉淀反應(IP)。待細胞生長融合至90%左右時將細胞培養瓶置于冰上，加入細胞質裂解液孵育1 h。4℃，1 000 r/min離心10 min，分離抽取上清液。取1 mg細胞裂解產物加入一抗于4℃過夜孵育。然后加入蛋白A-瓊脂糖4℃振搖24 h。用洗滌緩沖液將沉淀洗滌5次，2倍SDS樣品緩沖液將沉淀重懸后上樣進行SDS-PAGE免疫印跡分析。

1.8統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、HSD-q檢驗。

2 結 果

2.1吉非替尼對HCC827細胞凋亡的影響 吉非替尼濃度依賴性對HCC827細胞的活力產生了顯著抑制，其中0.00 μmol/L相對細胞活性為(100.0±5.4)%，0.01 μmol/L為(87.2±5.3)%，0.10 μmol/L為(49.0±4.9)%，1.00 μmol/L為(34.1±5.8)%，5.00 μmol/L為(32.7±5.9)%，10.00 μmol/L為(14.9±5.0)%(F=115.908,P=0.000)。流式細胞儀檢測發現吉非替尼時間依賴性促進了HCC827細胞凋亡，其中0 h細胞凋亡率為1.0%，3 h為6.4%，6 h為12.7%，12 h為20.6%，18 h為33.9%，24 h為65.8%。

2.2吉非替尼通過激活Caspase8和促進p27蛋白表達誘導細胞凋亡 吉非替尼處理HCC827細胞24 h后檢測到有活性的裂解Caspase8(p18)和Caspase3的18片段，與PARP降解的時間進程相似。緊接著有活性的Caspase8和Caspase8的中間降解產物p43及p41在吉非替尼處理18 h后同樣被明顯的檢測出來。與此相反，能夠啟動細胞凋亡通路的Caspase9在這個過程中并未發現顯著活化現象。促凋亡蛋白Bax和Bad及抗凋亡蛋白Bal-2和Bcl-xl的表達在吉非替尼干預后同樣未發現有顯著改變。當HCC827細胞分別接受吉非替尼處理0、3、6、18和24 h后，有效抑制了EGFR和Akt的磷酸化狀態，同時在吉非替尼干預18 h后p27蛋白的表達出現顯著上調(F=123.019，P=0.000)。其中0 h時p27蛋白灰度值為5.8±2.3，3 h為2.2±2.1，6 h為4.5±2.4，18 h為32.3±2.6，24 h為35.1±2.6。但是在同樣情況下并未發現p21蛋白的表達增加，見圖1。

2.3吉非替尼促進p27蛋白由胞核到胞質的轉位 見圖2，圖3。隨著處理時間的增加，p27蛋白含量在細胞質顯著升高(0 h:52.5±4.7,3 h:53.5±6.3,6 h:48.3±6.1,18 h:80.5±6.8,24 h:105.2±8.6;P<0.05)，但在細胞核中卻隨之降低(0 h:59.5±8.0,3 h:74.4±9.2,6 h:73.7±10.5,18 h:65.1±8.8,24 h:46.2±7.5)。隨著吉非替尼處理時間的增加，p27蛋白在細胞核和細胞質中亞細胞定位與Western印跡分析結果均一一對應。

圖1 吉非替尼通過激活Caspase8和提高p27蛋白表達水平誘導HCC827細胞凋亡

圖2 Western印跡檢測細胞質(C)和細胞核(N)裂解物中p27蛋白相對含量

2.4吉非替尼對細胞質中p27與Caspase8中間體p43/p41結合的影響 吉非替尼促進了細胞質中p27蛋白的表達和Caspase8的活化。吉非替尼處理24 h后，用抗p27蛋白抗體和抗Caspase8抗體對胞質蛋白進行免疫共沉淀反應。吉非替尼處理后檢測到Caspase8的裂解中間體p43/p41。利用抗p27蛋白抗體進行免疫沉淀并未檢測到總長度為57 kD的Caspase8。吉非替尼處理18 h和24 h后細胞質中p27蛋白和Caspase8的信號增強且結合在一起，見圖4。

圖3 吉非替尼處理不同時間共聚焦顯微鏡下p27蛋白表達(比例尺=20 μm)

a、b：抗p27蛋白抗體(a)、抗Caspase8抗體(b)對細胞質溶解產物孵育的IP結果；c：免疫細胞化學染色(比例尺= 20μm)圖4 吉非替尼誘導細胞質中p27與Caspase8降解中間體p43/p41結合

3 討 論

EGFR家族廣泛表達的跨膜酪氨酸激酶參與多種腫瘤的發生發展。根據受體和配體的結合特點，同源或異源二聚體的受體類型及細胞質中酪氨酸殘基的自身磷酸化產生的信號級聯反應導致細胞增殖、血管生成、細胞遷移和凋亡抑制〔8〕。靶向EGFR已經成為一種切實可行的針對晚期NSCLC患者的治療策略。吉非替尼作為口服小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑，目前已廣泛應用于NSCLC的臨床治療。部分NSCLC患者存在EGFR酪氨酸激酶結構域突變，且這種突變在亞洲不吸煙的患腺癌的女性中尤為常見〔9〕。EGFR突變預示著其對酪氨酸激酶抑制劑具有極高的反應率〔10〕。盡管臨床效果值得肯定，但吉非替尼誘導細胞凋亡和細胞周期抑制的機制迄今仍不明確。

p27蛋白在多種細胞的增殖、分化和死亡中發揮關鍵作用〔11〕。研究報道，p27蛋白對腫瘤細胞具有促凋亡作用，通過重組腺病毒對p27過表達引起了腫瘤相關細胞系的凋亡〔12〕。此外，已經發現在肺癌細胞系中p27蛋白過表達引起的細胞死亡可能受到pRb蛋白的調控〔13〕。而且，有研究發現，對比于高表達p27蛋白，胃癌中p27蛋白的低表達展現了一個較低水平的細胞凋亡和較差的不良預后〔14〕。p27蛋白的亞細胞定位對于其功能的發揮至關重要。前人已在多種人類腫瘤中檢測到p27蛋白的細胞質定位〔15〕。本研究發現NSCLC細胞系中p27蛋白的細胞質定位可能是由于吉非替尼誘導的p27蛋白的動態核轉出所引發。

本文同樣發現吉非替尼誘導的細胞凋亡與Caspase8的激活相關。Caspase8的兩條主要凋亡路徑已被確定〔16〕。受體-配體作為外在凋亡路徑需要配體結合到細胞表面受體，引起受體寡聚化，激活起始凋亡蛋白酶Caspase8。第二條為從細胞內部激活凋亡蛋白酶的線粒體途徑，這個內在路徑受到Bcl-2蛋白家族調控并通過Caspase9啟動信號級聯。本研究還發現數種Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡蛋白Bax、Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl在吉非替尼干預后表達并未發生顯著改變。由于Caspase9在吉非替尼干預后同樣未檢測到明顯激活現象，因此猜測吉非替尼在HCC827細胞中并未通過內部凋亡路徑誘導細胞凋亡。有研究報道，在腫瘤細胞中Caspase8調控的細胞凋亡與p27蛋白有關〔17〕。在骨肉瘤中，蛋白酶體抑制劑MG132誘導的細胞凋亡過程中同時檢測到Caspase8的激活增強及p27蛋白表達增加〔18〕。根據本研究結果猜測，吉非替尼干預NSCLC細胞后，細胞質中p27蛋白的表達升高和Caspase8的激活增強可能協同導致細胞凋亡。同樣還發現吉非替尼的干預導致細胞質中p27蛋白與Caspase8的裂解中間體p43/p41結合。長度為57 kD的Caspase8已知是被含有前肽結構域和p18亞基的中間體p43/p41催化激活。隨后，中間體p43/p41從功能前區釋放粘連有p18的活性部位。此外，通過抑制p27蛋白的細胞質易位發現吉非替尼誘導的細胞死亡率下降，推斷p27蛋白的核轉位與Caspase8的結合在吉非替尼誘導的細胞凋亡進程中極為關鍵。

本文結果表明，大部分HCC827細胞在吉非替尼處理24 h后凋亡，但與免疫熒光檢測結果不相符。究其原因發現，在免疫熒光法中，細胞必須被固定、透明化處理并在抗體孵育前對細胞進行沖洗。通過這一系列步驟，死亡的懸浮細胞被洗掉，而只有貼壁的活細胞被熒光檢測。然而，無論是PARP或Caspase的裂解，還是p27蛋白的表達升高及其細胞質易位，在吉非替尼處理18 h后才被Western印跡清晰地檢測到。推測這種結果差異很可能是Western操作中抗體對這些蛋白的敏感性差異所致。

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R73

A

1005-9202(2017)23-5771-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.011

1 武漢市第一醫院病理科

馮 燕(1977-)，女，主治醫師，主要從事病理學研究。

楊 暢(1978-)，男，主治醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

〔2017-05-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)