糖尿病小鼠骨骼肌FoxO1及PPARγ的表達及意義

廖 鑫 陳其榮 陽 琰 高 琳 鄧凡曲 張 晗 張 凌 牟芝群

(遵義醫學院附屬醫院內分泌科，貴州 遵義 563003)

糖尿病小鼠骨骼肌FoxO1及PPARγ的表達及意義

廖 鑫 陳其榮 陽 琰 高 琳 鄧凡曲1張 晗 張 凌 牟芝群

(遵義醫學院附屬醫院內分泌科，貴州 遵義 563003)

目的觀察KKAy糖尿病小鼠骨骼肌組織中叉頭狀因子(Fox)O1、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ的表達,探討FoxO1的表達與糖脂代謝的關系。方法8周齡KKAy小鼠8只為糖尿病模型組(DM)，予以高脂飼料喂養；8周齡C57BL/6J小鼠16只，隨機分為空白對照組(NC)8只、高脂喂養組(HFD)8只。喂養至16 w后檢測3組小鼠空腹血糖(FBG)、胰島素(Ins)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測骨骼肌組織FoxO1及PPARγ mRNA表達，Western印跡檢測骨骼肌組織中FoxO1蛋白表達。結果DM組FBG、TG、TC、LDL-C、Ins和HOMA-IR水平均較NC組及HFD組顯著升高(P<0.05)，HFD組小鼠Ins、TC、LDL-C和HOMA-IR較NC組顯著升高(P<0.05)；DM組PPARγ mRNA較NC組及HFD組均顯著降低(P<0.01)，HFD組PPARγ mRNA較NC組顯著降低(P<0.05)；DM組FoxO1 mRNA及蛋白表達較NC組及HFD組均明顯增高(P<0.05)。DM組骨骼肌FoxO1 mRNA表達與FBG(r=0.910,P<0.01)、Ins(r=0.864,P<0.01)、TG(r=0.897,P<0.01)和HOMA-IR(r=0.944,P<0.01)呈正相關，與PPARγ mRNA呈負相關(r=-0.719,P<0.01)。結論FoxO1的表達與糖血脂代謝密切相關。

叉頭狀因子O1；糖尿病；過氧化物酶體增殖物激活受體

近年研究顯示，胰島素抵抗及糖尿病發生發展與叉頭狀因子(Fox)O1相關〔1，2〕,其在肝臟通過增加葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)表達而使肝臟糖異生增加，可以使β細胞去分化〔3〕；在脂肪組組織，FoxO1 通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ的表達阻止脂肪細胞分化，進一步導致胰島素抵抗〔4〕；FoxO1可上調骨骼肌組織丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)4基因表達,減少糖利用，導致胰島素抵抗〔2〕。然而目前有關FoxO1在糖代謝中的作用機制并未完全闡明。本文采用KKAy糖尿病小鼠模型,觀察其骨骼肌組織中PPARγ、FoxO1 mRNA及蛋白表達變化。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性KKAy小鼠，體重約30 g，8周齡；同周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重約20 g，均由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK(京)2009-0004。C57BL/6J小鼠16只，根據飼料不同隨機分為空白對照組(NC)8只和高脂喂養組(HFD)8只。KKAy小鼠8只，予專用高脂飼料喂養至16 w后，斷尾取血測空腹血糖(FBG)(強生穩豪倍優型血糖儀)，2次FBG均≥13.9 mmol/L為糖尿病模型，8只全部成模。麻醉后眼球取血并取骨骼肌標本及血清，-80℃冰箱凍存。全自動生化分析儀(Olympus AU2700型)檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清胰島素(Ins,美國RD公司)。穩態模型的胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FBG×Ins)/22.5，胰島素敏感指數(ISI)=1/FBG×Ins。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測FoxO1及PPARγ mRNA的表達 腹腔注射水合氯醛麻醉后，取骨骼肌組織約100 mg置于800 μl Trizol中，-80℃冰箱凍存。提取骨骼肌組織總RNA并逆轉錄為cDNA，引物由寶生物公司合成(β-actin上游引物CATCCgTAAAgACCTCTATgCCAAC，下游引物TggAgCCACCgATCCACA；FoxO1上游引物GCACAGTGAACTCCAGGAAAGG，下游引物CACCAAAGGAAATGAATCAAACAAG；PPARγ上游引物AGACAAGACCAGTGAACTAAGGGAT，下游引物AGGAAGAGCAAGAAGGCGACA)；采用BIO-RAD公司icycler熒光定量PCR儀測定。反應條件：95.0℃×3 min；95.0℃×10 s，60.0℃×45 s，40個循環。

1.2.2Western印跡檢測FoxO1 蛋白表達 ①組織總蛋白提取及定量：取少量骨骼肌冰上剪碎后加細胞裂解液勻漿，離心，取上清，并用BCA法測定組織蛋白濃度。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：變性，取上清液加入5倍上樣緩沖液混勻，95℃加熱變性5 min；制備10%的分離膠及5%的濃縮膠，電泳完畢采用濕轉法，將蛋白轉移到PVDF膜上，PVDF膜與一抗FoxO1(1∶1 000，Abcam公司)結合過夜，次日洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶2 000，碧云天公司)，室溫孵育1 h,采用增強化學發光法顯色，在BIO-RAD凝膠成像儀中曝光，結果采用Quantity One定量分析系統進行灰度測定。

1.3統計學處理 應用SPSS19.0軟件，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，相關性采用Pearson相關分析。

2 結 果

2.1小鼠代謝指標比較 DM組TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG、Ins及HOMA-IR水平較NC組及HFD組明顯升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01)；與NC組比較，HFD組TC、HDL-C、LDL-C及HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2FoxO1及PPARγ mRNA表達 DM組骨骼肌FoxO1 mRNA表達量(48.47±2.46)較NC組(18.26±2.49)、HFD組(20.00±2.06)明顯增高(P<0.01)，PPARγ mRNA表達量(0.50±0.03)較NC組(1.61±0.15)、HFD組(0.73±0.03)明顯降低(P<0.05)。

表1 三組小鼠代謝指標比較

與NC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與HFD組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3FoxO1 蛋白表達 DM組骨骼肌FoxO1 蛋白表達(4.73±0.79)較NC組(0.91±0.17)、HFD組(1.26±0.16)明顯增高(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測FoxO1 蛋白表達

2.4FoxO1 mRNA與生化指標及PPARγ相關性 FoxO1 與PPARγ呈負相關(r=-0.719，P<0.01)，與TG、TC、LDL-C,FBG、Ins、 HOMA-IR顯性正相關(r分別為0.897、0.903、0.840、0.910、0.864、0.944，均P<0.01)，與ISI負相關(r=-0.929，P<0.01)。

3 討 論

FoxO1 是胰島素信號通路中下游的關鍵信號分子，其上游主要受磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)調控〔2〕。FoxO1 位于細胞核內,能夠促進細胞內葡萄糖合成關鍵酶的合成，胰島素激活PI3K/Akt途徑可使FoxO1 轉錄因子磷酸化而移出細胞核,阻斷其促進葡萄糖合成酶的作用。近年研究表明，FOX已經成為一種新的能量代謝的調節器和胰島素信號靶點〔5〕。

本實驗數據顯示FoxO1增加使胰島素敏感性降低，胰島素抵抗加重，這一研究顯示FoxO1參與了胰島素抵抗的發展。FoxO1在骨骼肌糖代謝調節中有一定作用，其調節骨骼肌糖代謝與丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)4有關，PDK4可刺激丙酮酸脫氫酶(PDC)磷酸化，從而降低丙酮酸脫氫酶的活性，減少丙酮酸進入三羧酸循環，降低饑餓時機體對糖的利用。有研究發現，在C2C12細胞中,PDK4結合于FoxO1基因啟動子區域從而使其表達上調〔2〕。Kousteni〔6〕提出，饑餓狀態下，FoxO1通過分解肌肉蛋白質提供能量供應，導致肌肉損耗和萎縮，進一步造成胰島素抵抗。同時，胰島素抵抗時PI3k/Akt受損，FoxO1未被磷酸化，從而核內FoxO1增多，導致血糖進一步升高。

FoxO1與PPARγ均為調節胰島素敏感性及葡萄糖代謝的重要轉錄因子，能調節葡萄糖轉運子(GLUT)-4的表達。Kim等〔7〕敲除FoxO1 基因可增加骨骼肌、肝臟胰島素敏感性，并且使PPARγ及其相關基因表達增加，并從體內、外水平證明FoxO1對 PPARγ的抑制。此后，Gupta等〔8〕證實FoxO1通過抑制胰腺十二指腸同源盒(PDX)-1的表達，進一步抑制PPARγ表達，導致胰島素抵抗。FoxO1 與血脂的代謝有關，可誘導骨骼肌中LPL基因表達增加，LPL可能是FoxO1在骨骼肌調節脂質代謝的靶點，骨骼肌高水平的LPL進一步引起胰島素抵抗〔9〕。FoxO1選擇性抑制劑AS1708727〔10〕、AS1842856〔11〕可以劑量依賴性地改善血脂異常，降低血糖。綜上，FoxO1參與胰島素抵抗及糖尿病發生發展，調控骨骼肌FoxO1的表達可能成為改善糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗的治療靶點。

1Kumashiro N,Beddow SA,Vatner DF,etal.Targeting pyruvate carboxylase reduces gluconeogenesis and adiposity and improves insulin resistance〔J〕.Diabetes,2013;62(7):2183-94.

2Sanchez AMJ,Candau RB,Bernardi H.FoxO transcription factors:their roles in the maintenance of skeletal muscle homeostasis〔J〕.Cell Mol Life Sci,2014;71(9):1657-71.

3Puri S,Hebrok M.Diabetic β cells:to be or not to be〔J〕?Cell,2012;150(6):1103-4.

4Andrade JMO,Paraíso AF,Garcia ZM,etal.Cross talk between angiotensin-(1-7)/Mas axis and sirtuins in adipose tissue and metabolism of high-fat feed mice〔J〕.Peptides,2014;55(1):158-65.

5Rached MT,Kode A,Silva BC,etal.FoxO1 expression in osteoblasts regulates glucose homeostasis through regulation of osteocalcin in mice〔J〕.J Clin Inves,2010;120(1):357.

6Kousteni S.FoxO1, the transcriptional chief of staff of energy metabolism〔J〕.Bone,2012;50(2):437-43.

7Kim JJ,Li P,Huntley J,etal.FoxO1 haploin sufficiency protects against high-fat diet-induced insulin resistance with enhanced peroxisome proliferator-activated receptor γ activation in adipose tissue〔J〕.Diabetes,2009;58(6):1275-82.

8Gupta D,Leahy AA,Monga N,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ ) and its target genes are downstream effectors of FoxO1 protein in islet β-cells mechanism of-cell compensation and failure〔J〕.J Biol Chem,2013;288(35):25440-9.

9Kamei Y,Mizukami J,Miura S,etal.A forkhead transcription factor FKHR up-regulates lipoprotein lipase expression in skeletal muscle〔J〕.FEBS Lett,2003;536(1):232-6.

10Tanaka H,Nagashima T,Shimaya A,etal.Effects of the novel Foxo1 inhibitor AS1708727 on plasma glucose and triglyceride levels in diabetic db/db mice〔J〕.Eur J Pharmacol,2010;645(1):185-91.

11Nagashima T,Shigematsu N,Maruki R,etal.Discovery of novel forkhead box O1 inhibitors for treating type 2 diabetes:improvement of fasting glycemia in diabetic db/db mice〔J〕.Mol Pharmacol,2010;78(5):961-70.

ExpressionandsignificanceofFoxO1andPPARγintheskeletalmuscleofKKAymice

LIAOXin,CHENQi-Rong,YANGYan,etal.

DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,Guizhou，China

ObjectiveTo observe the expression of FoxO1 and PPARγ in skeletal muscle of KKAy mice and explore the relationship between FoxO1 and glycolipid metabolism.MethodsKKAy mice with the high-fat diet were chosen into the diabetic model group (DM) (n=8),C57BL/6J mice were randomly divided into control group (NC) (n=8)and the high-fat diet group (HFD) (n=8).The blood samples were used for measuring fasting blood glucose (FBG), serum insulin (Ins), triglyceride (TG), total cholesterol(TC),high density lipoprotein-C(HDL-C) and low density lipoprotein-C (LDL-C).16 weeks later, insulin resistance was assessed by HOMA-IR. The FoxO1 and PPARγ mRNA expression levels in skeletal muscle were detected by real time quantitative(RT-PCR). The FoxO1 protein expression was detected by Western bolt method.ResultsLevels of FBG, TG, TC,LDL-C, Ins and HOMA-IR were significantly higher in DM group than those in control group and high-fat diet group. Levels of Ins, TC,LDL-C and HOMA-IR were significantly higher in the high-fat diet group than those in control group. The mRNA expression of PPARγ in skeletal muscle of DM group(0.56±0.05)was reduced when compared with control group(1.90±0.13)and the high-fat diet group(0.91±0.06)(P<0.01), the PPARγ mRNA expression in the high-fat group was lower than that of the control group(P<0.05). The mRNA level of FoxO1 in skeletal muscle of DM group(48.47±2.46)was higher than that of control group(18.26±2.49)and the high-fat diet group(20.00±2.06)(P<0.05). The protein expression of FoxO1 in skeletal muscle of DM group(4.73±.079) was higher than that of control group(0.91±0.17)and the high-fat diet group(1.26±0.16)(P<0.05). Moreover, the mRNA expression of FoxO1 in skeletal muscle was positively correlated with FBG(r=0.910,P<0.01), Ins(r=0.864,P<0.01), TG(r=0.897,P<0.01) and HOMA-IR(r=0.944,P<0.01); negatively correlated with PPARγ mRNA expression(r=-0.719,P<0.01).ConclusionsThe expression of FoxO1 is closely correlated with the glucose and lipid metabolism.

Forkhead box O1; Diabetes; Peroxisome proliferators-activated receptors

R587

A

1005-9202(2017)23-5759-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.006

國家自然科學基金(No.81660142);貴州省社會發展攻關項目〔SY(2013)3033〕

1 遵義醫藥高等專科學校護理系

高 琳(1962-)，女，教授，主要從事內分泌代謝性疾病基礎及臨床研究。

廖 鑫(1979-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事內分泌代謝性疾病基礎及臨床研究。

〔2016-12-19修回〕

(編輯 李相軍/徐 杰)