慢性間歇性低氧對頸動脈體缺氧誘導因子-α亞型的影響

李超紅 賈祥磊 黃 璐 劉玉珍

(新鄉醫學院第一附屬醫院 河南省神經修復重點實驗室 河南省神經病學研究所，河南 衛輝 453100)

基礎研究·

慢性間歇性低氧對頸動脈體缺氧誘導因子-α亞型的影響

李超紅 賈祥磊 黃 璐 劉玉珍

(新鄉醫學院第一附屬醫院 河南省神經修復重點實驗室 河南省神經病學研究所，河南 衛輝 453100)

目的探討缺氧誘導因子(HIF)-α亞型在頸動脈體可塑性中的作用。方法給SD大鼠慢性間歇性低氧每天8 h，處理3 w后，收獲頸動脈體，提取RAN，用RT-PCR方法檢測HIF-α亞型在頸動脈體的表達。結果大鼠頸動脈體表達HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α mRNA。慢性間歇性低氧處理后，大鼠頸動脈體HIF-2α和HIF-3α mRNA表達量增高，但是HIF-1α mRNA表達量無變化。結論大鼠頸動脈體表達三種HIF-α亞型，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-2α和HIF-3α參與慢性間歇性低氧引起的頸動脈體化學感受性反射的可塑性。

慢性間歇性低氧；低氧誘導因子；頸動脈體

頸動脈體(CB)在慢性低氧環境中能自發性適應和調節〔1～3〕。不論是循環間歇性低氧還是持續性低氧均可通過調控CB內多種神經遞質以及神經調質信號通路分子水平，引起CB化學感受性反射的可塑性，然而其機制尚未明確。低氧誘導因子(HIF)-α是一種細胞低氧條件下誘導的轉錄因子〔4〕，與其靶基因啟動子特異序列結合，調控其靶基因的轉錄。HIF-α包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三種亞型，不同HIF-α亞型對急慢性低氧的反應不同。血管內皮生長因子(VEGF)是一種高度保守的同源二聚體糖蛋白，是血管內皮特異性的肝素結合生長因子，可通過多種方式誘導血管生成〔5〕。HIF-α與VEGF基因啟動子的特定序列結合促進VEGF的轉錄。Sondell等〔6〕發現，在VEGF高表達的膠質細胞中也發現有HIF-1α的表達，且二者的分布位置一致。研究發現〔7〕，低氧可使VEGF的表達量明顯增高，可能參與低氧的代償作用。本研究檢測三種HIF-α亞型mRNA在CB的表達以及慢性間歇性低氧(CIH)對其在CB表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性SD大鼠，SPF級，由河南省實驗動物中心提供(編號：41003100001855)。實驗起始大鼠體重240～250 g(8周齡)，每天自由進食、水。

1.1.2試劑 Trizol購自Ambion公司；引物購自華大基因科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自Takara公司；PCR試劑盒購自QIAGEN公司；其他試劑購自天津恒興化學試劑廠。

1.2方法

1.2.1循環間歇性低氧模型制備 利用美國Biospherix公司的Oxycycler A84，制備循環CIH大鼠模型。SD大鼠隨機分為對照組和CIH組，分別置于特制低氧室，按照設定的程序，計算機自動控制注入氧氣或氮氣。每個周期6 min。CIH前2 min充入100% N2，氧濃度分數逐漸降低至最低點10%，并在10%維持3 min。最后1 min充入21%氧氣，氧濃度分數逐漸恢復至21%。對照組充入空氣代替氮氣。每天8 h，持續14 d。

1.2.2收集CB組織 大鼠用異氟烷麻醉，迅速斷頭，并置于冰冷的生理鹽水中。外科顯微鏡下迅速游離雙側頸動脈分叉，進一步于體視顯微鏡下小心仔細游離CB，并置于RNA later,-80℃保存備用。

1.2.3引物設計 根據大鼠基因組序列設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.2.4RNA提取和RT-PCR 由于CB組織非常小，把來源于10只大鼠的CB混合在一起提取RNA。根據說明書，應用Trizol法提取總RNA。取500 ng RNA根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，總體積20 μl，37℃反應15 min，85℃反應5 s。用2 μl cDNA和1個單位Hotstartaq DNA聚合酶進行PCR，總體積20 μl。PCR程序：初始15 min、95℃的初始活化激活Hotstartaq DNA聚合酶，其次是94℃、1 min變性，50 s退火(根據不同引物的退火溫度)和72℃ 50 s延伸獲得PCR擴增產物。對擴增產物進行1.2%(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分析，溴乙錠染色，在紫外光下顯影。以β-actin作為內參。

1.3統計學方法 應用 SPSS16.0軟件行方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1HIF-α亞基在大鼠CB組織中的表達情況 大鼠CB HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α表達豐度均低于陽性對照大鼠大腦皮質。見圖1。

圖1 大鼠CB表達三種HIF-α亞基

2.2CIH對大鼠CB各HIF-α亞基表達的影響 大鼠循環間歇性低氧處理2 w后，HIF-2α、HIF-3α mRNA水平均比對照組增加(P<0.05)，而HIF-1α mRNA水平無明顯改變。見圖2。

與對照組相比：1)P<0.05圖2 CIH對大鼠CB中HIF-α mRNA水平的影響

2.3CIH對大鼠CB中VEGF表達情況的影響 CIH處理2 w后，CIH組大鼠CB的VEGF水平明顯高于對照組(P<0.05，n=6)。見圖3。

圖3 CIH對大鼠CB中VEGF表達水平的影響

3 討 論

CB是體內重要的氧感受器官〔2〕，缺氧可導致其發生可塑性改變，但具體機制尚未完全闡明。根據本研究結果推測，HIF-α引起的VEGF表達水平升高可能參與循環間歇性低氧所致CB可塑性。

HIF-α是一種細胞低氧條件下誘導的轉錄因子〔4〕，缺氧條件下其降解受到限制，轉錄活性增強，在細胞核中與HIF-α形成異二聚體，通過HIF-α與其靶基因啟動子特異序列結合，調控其靶基因的轉錄，發揮一系列生物學活性；VEGF是其靶基因之一。近年來，HIF-α在中樞神經系統中的作用被廣泛關注〔8〕，研究發現，HIF-α在腦缺血缺氧損傷中具有神經保護作用。推測其機制之一可能與缺氧后HIF-α調控其靶基因VEGF表達增加相關，從而促進新生血管形成，改善腦組織的血流供應，使腦缺血得到恢復。CB作為神經源性組織，是機體重要的氧感受器官。阻塞性睡眠呼吸暫停的病理特征之一是循環間歇性低氧。循環間歇性低氧通過改變CB可塑性，使得交感神經活性增強。 CIH誘發的CB可塑性變化是阻塞性睡眠呼吸暫停繼發高血壓的發病機制之一，然而這種CB可塑性變化的機制尚未完全闡明〔9〕。本結果證實，CB表達三種HIF-α亞基，并CIH增加HIF-2α及HIF-3α mRNA表達量,但不影響HIF-1α mRNA的表達。推測不同HIF-α亞型對低氧具有時效性反應。并且CIH明顯增加HIF-α 靶基因VEGF mRNA表達量。

1Conde SV,Sacramento JF,Guarino MP,etal.Carotid body,insulin,and metabolic diseases:unraveling the links〔J〕.Front Physiol,2014；5(4):418.

2Mifflin S,Cunningham JT,Toney GM.Neurogenic mechanisms underlying the rapid onset of sympathetic responses to intermittent hypoxia〔J〕.J Appl Physiol (1985),2015；119(12):1441-8.

3Basaran KE,Villongco M,Ho B,etal.Ibuprofen Blunts Ventilatory Acclimatization to Sustained Hypoxia in Humans〔J〕.PLoS One,2016；11(1):e0146087.

4Hu YY,Fu LA,Li SZ,etal.Hif-1α and Hif-2α differentially regulate Notch signaling through competitive interaction with the intracellular domain of Notch receptors in glioma stem cells〔J〕.Cancer Lett,2014；349(1):67-76.

5Dzietko M,Derugin N,Wendland MF,etal.Delayed VEGF treatment enhances angiogenesis and recovery after neonatal focal rodent stroke〔J〕.Transl Stroke Res,2013；4(2):189-200.

6Sondell M,Sundler F,Kanje M.Vascular endothelial growth factor is a neurotrophic factor which stimulates axonal outgrowth through the flk-1 receptor〔J〕.Eur J Neurosci,2000；12(12):4243-54.

7Marti HJ,Bernaudin M,Bellail A,etal.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression precedes neovascularization after cerebral ischemia〔J〕.Am J Pathol,2000；156(3):965-76.

8Lin D,Zhou L,Wang B,etal.Overexpression of HIF-1α in mesenchymal stem cells contributes to repairing hypoxic-ischemic brain damage in rats〔J〕.C R Biol,2017；340(1):18-24.

9Iturriaga R,Andrade DC,Del Rio R.Enhanced carotid body chemosensory activity and the cardiovascular alterations induced by intermittent hypoxia〔J〕.Front Physiol,2014；5:468.

TheeffectofchronicintermittenthypoxiaonHIF-αsubunitexpressionintheratcarotidbody

LIChao-Hong,JIAXiang-Lei,HUANGLu,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,HenanKeyLaboratoryofNeuralRegenerationandRepairment,Weihui453100,Henan,China

ObjectiveTo investigate the effect of chronic intermittent hypoxia on the HIF-α subtype expression in rat carotid body.MethodsSD male rats were treated with chronic intermittent hypoxia for 8 hours a day, total 2 weeks. Then the carotid bodies were collected and total RNA were extracted. HIF-α subtypes were examined by RT-PCR.ResultsThe rat carotid body expressed HIF-1α, HIF-2α and HIF-3α mRNA. Chronic intermittent hypoxia increased HIF-2α and HIF-3α mRNA levels, but not influenced HIF-1α mRNA level. VEGF mRNA in rat carotid body was upregulated by chronic intermittent hypoxia.ConclusionsThe rat carotid body expresses three HIF-α subtypes, HIF-2α and HIF-3α but not HIF-1α might be involved in the VEGF upregulation which is considered to be associated with carotid body chemoreflex plasticity induced by chronic intermittent hypoxia.

Chronic intermittent hypoxia; HIF-α; Carotid body

R339.17+2

A

1005-9202(2017)23-5745-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.001

國家自然科學基金(81470271)

劉玉珍(1964-)，女，教授，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停相關研究。

李超紅(1988-)，女，助理實驗員，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停相關研究。

〔2017-09-11修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)