山茱萸提取物對大鼠原發性肝癌組織中B7-H6表達的影響

肖鵬 白樺 栗敏 劉桂舉 李瑞君 梅家轉

山茱萸提取物對大鼠原發性肝癌組織中B7-H6表達的影響

肖鵬 白樺 栗敏 劉桂舉 李瑞君 梅家轉

目的：探討山茱萸提取物對原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）大鼠B7-H6表達的影響。方法：選取60只SD大鼠隨機分為模型組、苦參堿組和山茱萸組，以二乙基亞硝胺誘發大鼠模型，分別給予苦參堿組和山茱萸組大鼠相應藥物灌胃，模型組大鼠給予0.9%NaCl溶液灌胃。計數各組大鼠肝臟表面的癌結節數及其抑瘤率；經H&E染色后觀察各組大鼠肝癌組織的病理學改變。應用免疫組織化學法和Western blot法檢測模型組、苦參堿組和山茱萸組大鼠肝癌組織中B7-H6的表達。結果：苦參堿組和山茱萸組大鼠的肝癌結節數明顯少于模型組（P＜0.05）；山茱萸組的抑瘤率顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。免疫組織化學結果顯示，山茱萸組和苦參堿組肝癌組織中B7-H6的陽性表達顯著高于模型組（P＜0.05），山茱萸組B7-H6的陽性表達顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。Western blot法結果顯示，山茱萸組和苦參堿組B7-H6的蛋白表達顯著高于模型組（P＜0.05），山茱萸組B7-H6的蛋白表達顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。結論：山茱萸提取物可能通過上調腫瘤組織B7-H6的表達，抑制大鼠肝癌組織的生長。

原發性肝癌 山茱萸提取 苦參堿 SD大鼠 B7-H6

原發性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國惡性腫瘤致患者死亡人數中排名第2位［1］。盡管手術治療仍為HCC的最有效的治療方式，但是對于部分無法行手術治療的HCC患者，特別是晚期HCC患者的治療一直未取得實質性進展。因此，基因治療顯得尤為重要。NK細胞是重要的抗腫瘤效應細胞，通過其表面的活化性受體識別腫瘤細胞表面對應的配體而行使其殺傷功能。腫瘤細胞表達的這些配體由自身基因編碼，通過應激條件在細胞表面過表達，因此被稱為應激誘導的識別［2］。NCR3（natural cytotoxicity receptors 3，NCR3）是新近發現的重要NK細胞活化性受體，B7-H6是已知唯一一種膜蛋白形式表達NCR3的配體，B7-H6在正常組織細胞表面不表達，卻能在腫瘤細胞表面表達［3］。有研究發現，B7-H6通過與NK細胞表面的活化受體NCR3結合激活并促進NK細胞釋放TNFα、IFNγ殺傷靶細胞等［4-5］，是NK細胞腫瘤免疫的重要機制之一。有研究表明，山茱萸提取物具有調節免疫、降低氧化應激以及抗腫瘤等作用［6］，但其機制尚不明確。本研究通過觀察山茱萸提取物對HCC大鼠模型HCC組織中B7-H6表達的影響，探討了其抑制HCC生長的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

SPF級Sprague Dawley雄性近交系大鼠60只，購自武漢大學實驗動物中心［動物生產許可證號為SCXK（鄂）2008-0004］，平均體質量為（200±20）g。HCC的HepG2細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑和儀器

山茱萸黃酮提取方法：山茱萸藥材粉碎以10倍量95%乙醇回流提取8 h，脫脂冷卻抽濾，濃縮，乙醇沉淀除去蛋白質，干燥得到粗提物［7］?？鄥A注射液購自山西振東泰盛制藥有限公司（批號：20059335）；二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購自美國Sigma公司；0.9%氯化鈉注射液購自山東魯抗辰欣藥業有限公司（批號：20071011）；免疫組織化學檢測試劑盒Max VisionTM和EDTA抗原修復液均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑購自丹麥Dako公司；RIPA buffer購自廣州泛思生物科技有限公司；兔抗人B7-H6多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗人β-actin多克隆抗體購自上海合星生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自上海酶聯生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司；四唑硝基藍（tetranitrobluetetrazolium chloride，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，BCIP）染色試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司；凝膠圖像處理系統購自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、動物模型建立及各組的給藥方法所有大鼠分籠飼養，各組均給予標準化飼料，自由飲水。實驗在通風、25℃、相對濕度為70%的二級生物安全（P2）實驗室進行。大鼠隨機分為模型組、苦參堿組和山茱萸組，20只/組。3組大鼠均腹腔注射DEN（50 mg/kg）建立HCC模型，1次/d，5次/周，共16周。第17周的首日，將山茱萸提取物60 mg/kg·d給予山茱萸組大鼠灌胃治療，灌胃容量為0.2 mL/10 g大鼠體質量，1次/d，連續給藥2周。將15 mL苦參堿（150 mg）溶入500 mL蒸餾水中，配成質量濃度為300 mg/L的苦參堿溶液，給予苦參堿組大鼠灌胃治療，灌胃容量為0.2 mL/10 g大鼠體質量，1次/d，連續給藥2周。模型組大鼠給予等量0.9%NaCl注射液灌胃。

1.3.2 觀察各組大鼠腫瘤的變化 各組大鼠給藥結束后24 h脫頸處死，觀察各組大鼠的腫瘤生長情況，仔細計數各組肝臟表面的HCC結節數，并且計算各組腫瘤形成率（腫瘤形成率=形成腫瘤的大鼠數/大鼠總數）。仔細剝離大鼠肝腫瘤組織，稱量模型組、苦參堿組和山茱萸組的大鼠瘤重，計算各組抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤重-山茱萸組或苦參堿組平均瘤重）/模型組平均瘤×100%［5］。

1.3.3 H&E染色觀察大鼠肝組織的病理學結構改變 選取各組大鼠的腫瘤組織標本，組織緩沖液沖洗干凈，再以3.5%甲醛溶液固定，石蠟包埋，進行4 μm連續切片，常規H&E染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠HCC組織的病理改變。

1.3.4 應用免疫組織化學法檢測各組大鼠HCC組織中B7-H6的表達 選取各組石蠟切片常規脫蠟水化，再以3%過氧化氫溶液抑制內源性過氧化物酶的活性，EDTA抗原修復液進行抗原修復；PBS沖洗，將1：75稀釋的兔抗人B7-H6多克隆抗體滴在切片上，放于4℃冰箱中過夜；滴加1：500稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，在室溫條件下反應10 min；使用DAB顯色，蘇木精對比染色；脫水，并用中性樹膠封片。實驗以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.3.5 應用Western blot法檢測各組大鼠HCC組織中B7-H6蛋白的表達水平 提取每組大鼠HCC組織，加入1 mL RIPA buffer裂解，于4℃離心5 min，取上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取10 μg/孔的蛋白質進行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白質電轉移至硝基纖維膜上并予5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1：1 000稀釋的兔抗人B7-H6或β-actin（內參照）多克隆抗體，在4℃冰箱中搖晃過夜；次日取出室溫下復溫30 min，TBST搖床洗滌3次，室溫避光孵育熒光二抗，應用Quality One軟件分析蛋白表達。

1.3.6 應用Western blot法檢測HCC的HepG2細胞B7-H6蛋白的表達水平 取對數生長期HepG2細胞消化，制備細胞懸液，調整細胞濃度為l×104/L，接種于6孔板內（2 mL/孔）。培養24 h后，分3組（模型組、苦參堿組、山茱萸組），再培養24 h。蛋白質濃度用BCA法檢測，各樣本稀釋成統一濃度，進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后，轉移到硝酸纖維素膜上，按1：1 000稀釋B7-H6抗體，在4℃孵育過夜，洗膜后，用1：2 000稀釋的二抗孵育2 h，應用Quality One軟件分析蛋白表達。

1.4 統計學分析

采用SPSS 15.0軟件對結果數據進行統計學分析。計量數據以表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法；抑瘤率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的腫瘤形成率、腫瘤結節數、腫瘤質量及抑瘤率的比較

模型組14只大鼠成瘤，苦參堿組和山茱萸組各有14和15只大鼠成瘤。模型組與兩組干預組的腫瘤形成率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組干預組的腫瘤結節數和腫瘤質量均明顯低于模型組（P＜0.05）。其中以山茱萸組的腫瘤質量最低（P＜0.05），其抑瘤率明顯高于苦參堿組大鼠（P＜0.05，表1）。

2.2 各組大鼠肝組織的病理學改變

H&E染色結果顯示，各組大鼠均形成肝細胞肝癌，模型組大鼠肝組織中肝索排列紊亂，肝竇變窄甚至消失，肝小葉內可見大量碎片狀壞死，壞死細胞周圍伴隨增生的纖維細胞和大量炎性細胞浸潤，形成數個假小葉，伴有顯著的肝細胞再生結節，并可見癌巢生成，癌細胞呈多形性和多角形，細胞核大，核仁明顯深染，同時可見多核巨細胞。山茱萸組和苦參堿組大鼠肝組織也有輕度破壞，但與模型組比較，肝細胞變性、壞死均顯著減輕，并且癌結節數、癌灶的數目及大小均有明顯地減少、縮小，可見細胞體積固縮，有部分細胞裂解，形成大小不一的凋亡小體狀結構和凋亡細胞核，染色質濃縮。與苦參堿組比較，山茱萸組大鼠肝組織炎性細胞浸潤減輕、癌結節數減少更顯著，可見更多凋亡小體（圖1）。

2.3 免疫組織化學法檢測各組大鼠肝組織中B7-H6蛋白的表達

免疫組織化學法檢測顯示，苦參堿組和山茱萸組大鼠HCC組織中B7-H6的陽性表達明顯高于模型組，山茱萸組大鼠HCC組織中B7-H6的陽性表達率明顯高于苦參堿組（圖2）。

表1 各組大鼠的腫瘤形成率、腫瘤結節數、腫瘤質量及抑瘤率的比較Table 1 Comparison of the tumor formation rate,tumor nodule number,tumor weight,and tumor inhibition rate of each group

圖1 各組大鼠肝組織的病理學改變 （H&E×200）Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of pathological changes of liver tissue in each group(H&E×200)

圖2 免疫組織化學法檢測各組大鼠肝組織中B7-H6蛋白的表達 （IM×200）Figure 2 Expression of B7-H6 protein in liver tissue was detected by immunohistochemistry(IM×200)

2.4 應用Western blot法檢測各組大鼠HCC組織B7-H6蛋白的表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與模型組大鼠比較，苦參堿組和山茱萸組HCC組織B7-H6蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC組織中B7-H6蛋白表達明顯升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot法檢測各組大鼠HCC組織B7-H6蛋白的表達Figure 3 B7-H6 expression in hepatocellular carcinoma tissues was detected by Western blot

檢測結果顯示，與對照組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC細胞B7-H6蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC細胞中B7-H6蛋白表達明顯升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot法檢測各組HepG2細胞B7-H6蛋白表達Figure 4 B7-H6 expression in HepG2 cells was detected by Western blot

3 討論

在惡性腫瘤中，HCC嚴重威脅人類生命，其發病特點為起病隱匿，患者早期常無明顯臨床表現，因此大多數患者在出現癥狀時已無手術時機，而對于這類患者的治療目前束手無策［8］。近年來采用傳統中醫藥治療癌癥成為研究熱點［9］。山茱萸作為臨床常用的一味扶正固本的中藥，在抗腫瘤方面已早有應用，如《醫學衷中參西錄》中含有山茱萸的定性湯可以護衛機體，斂陰止汗治療腫瘤后期的驚悸，氣滯血瘀等。近期也有研究表明，山茱萸可以抑制人肺癌細胞的增殖［10］，且山茱萸可以調節荷瘤小鼠的免疫狀態來發揮抗腫瘤作用［11］，但其抗腫瘤的作用機制尚無詳細報道。

有研究發現，山茱萸提取物在體內外對Lewis肺癌細胞均有抑制作用，其作用機制與誘導腫瘤細胞的凋亡和干擾細胞周期分布有關［11］。本研究發現兩組干預組的腫瘤結節數和腫瘤質量均明顯低于模型組，其中以山茱萸組的腫瘤質量最低，其抑瘤率明顯高于苦參堿組大鼠。在H&E染色結果方面，苦參堿組與山茱萸組的肝臟病理學變化得到明顯的改善，其中以山茱萸組的改善效果最佳。Wang等［10］通過免疫組織化學法發現，山茱萸多糖能夠促進Bax的表達，誘導Hela細胞凋亡。本研究通過免疫組織化學法的檢測結果顯示，苦參堿組和山茱萸組大鼠B7-H6的陽性表達明顯高于模型組，山茱萸組B7-H6的陽性表達明顯高于苦參堿組。應用Western blot法檢測結果顯示，與模型組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC組織B7-H6蛋白表達明顯升高；而與苦參堿組比較，山茱萸組B7-H6蛋白表達明顯升高。為了進一步驗證山茱萸提取物抑制HCC與共刺激因子B7-H6的表達有關，本研究在體外實驗即HCC細胞HepG2中同樣發現，與模型組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC細胞B7-H6蛋白表達明顯升高；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC細胞中B7-H6蛋白表達明顯升高。

綜上所述，山茱萸提取物可抑制HCC的生長，其可能的機制與共刺激因子B7-H6的表達有關。

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Effect of Fructus Corni extract on B7-H6 expression in primary liver cancer of rats

Peng XIAO,Hua BAI,Min LI,Guiju LIU,Ruijun LI,Jiazhuan MEI

Department of Oncology,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou 450053,China

Jiazhuan MEI;E-mail:mjzhuan@163.com

Objective:To investigate the effects of Fructus Corni extract on the B7-H6 expression in primary liver cancer cells of rats.Methods:Sixty SD rats were randomly divided into three groups,namely,model,matrine,and Cornus officinalis.The rat model bearing the primary liver cancer was induced by diethylnitrosamine,except for the rats in the control group.The rats in both the matrine and Cornus officinalis groups were fed with matrine and Cornus officinalis.The rats in model groups were fed with 0.9%sodium chloride solution.The number of hepatocellular carcinoma nodules was calculated,and the tumor growth inhibition rate was also calculated.The pathological changes of hepatic tissues in rats of each group were observed by hematoxylin and eosin staining.The expression levels of B7-H6 in these three groups were determined by immunohistochemistry and Western blot.Results:The number of liver nodules of the matrine and Fructus Corni group rats was lower than that of the model group(P＜0.05).The tumor inhibition rate of the Cornus group was significantly higher than that of the matrine group(P＜0.05).The tumor growth inhibition rate of the Cornus officinalis group was significantly higher than that of the matrine group(P＜0.05).Immunohistochemistry showed that the positive expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group and the matrine group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05),and the positive expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group was significantly higher than that in the matrine group(P＜0.05).Similarly,the protein expression of B7-H6 in the Cornus officinalis and matrine groups was significantly higher than that in the model group(P＜0.05)by Western blot,while the protein expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group was significantly higher than that in the matrine group(P＜0.05).Conclusion:Fructus Corni extract may inhibit the growth of hepatocellular carcinoma through upregulating the B7-H6 expression.

primary hepatocarcinoma,Cornus officinalis extract,matrine,SD rats,B7-H6

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.376

鄭州人民醫院腫瘤內科（鄭州市450053）

梅家轉 mjzhuan@163.com

（2016-12-05收稿）

（2017-08-08修回）

（編輯：鄭莉 校對：孫喜佳）

肖鵬 專業方向為肺癌、消化系統腫瘤的綜合治療。

E-mail：zzrmyyxiaopeng@sina.com