熱缺血時(shí)間對(duì)循環(huán)停止豬心供體冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響

蘇陽(yáng) 秦廣啟 廖秋明 Stig Steen 喬晨暉

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心外科 河南 鄭州 450052；2.隆德大學(xué)醫(yī)院 心胸外科 瑞典 22594)

熱缺血時(shí)間對(duì)循環(huán)停止豬心供體冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響

蘇陽(yáng)1秦廣啟2廖秋明2Stig Steen2喬晨暉1

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心外科 河南 鄭州 450052；2.隆德大學(xué)醫(yī)院 心胸外科 瑞典 22594)

目的探究熱缺血時(shí)間對(duì)循環(huán)停止豬心供體(DCD)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。方法將18頭健康瑞典家豬隨機(jī)分為對(duì)照組、熱缺血30 min組、熱缺血40 min組，每組6只。將對(duì)照組冠狀動(dòng)脈前降支遠(yuǎn)端血管截成血管環(huán)進(jìn)行器官浴槽實(shí)驗(yàn)；另外兩組采用腔靜脈插管將循環(huán)血液排空建立失血DCD模型，將心臟遺留在胸腔內(nèi)，分別在30 min和40 min后進(jìn)行器官浴槽實(shí)驗(yàn)(方法同對(duì)照組)。比較3組內(nèi)皮依賴性舒張功能(EDR)。結(jié)果對(duì)照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組最大內(nèi)皮依賴性舒張百分?jǐn)?shù)(EDRmax)分別為(95.72±0.95)%、(95.09±0.85)% 和(94.41±1.06)%，3組EDRmax比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組P物質(zhì)半最大效應(yīng)濃度負(fù)對(duì)數(shù)(pEC50)分別為(6.53± 0.07)%、(6.43±0.02)%和(6.38±0.04)%，3組pEC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論在實(shí)驗(yàn)條件下，熱缺血30 min及40 min對(duì)豬循環(huán)停止豬心供體冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能無(wú)顯著影響。

循環(huán)停止供體；熱缺血；內(nèi)皮細(xì)胞；心臟移植

器官移植是各器官終末期疾病的有效治療手段，然而供體器官的缺乏仍舊是制約器官移植發(fā)展的主要問(wèn)題。為了填補(bǔ)器官需求與供體數(shù)量的缺口，循環(huán)停止供體(donation after circulatory death，DCD)又重新回歸醫(yī)學(xué)視野。Ali等[1]使用豬心進(jìn)行循環(huán)停止實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示DCD供心移植術(shù)后心室功能恢復(fù)正常；Tolboom等[2]通過(guò)體外灌注裝置研究證實(shí)DCD供心的熱缺血損傷可以恢復(fù)。DCD供體可作為肝、腎來(lái)源已得到臨床證實(shí)和應(yīng)用[3-4]。由于心臟生理代謝的特殊性及DCD供體引起的不可避免性熱缺血損傷，DCD供心的臨床可行性需要進(jìn)一步研究[5]。本研究通過(guò)探討不同熱缺血時(shí)間對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響，為DCD供心的臨床可行性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄不限的健康家豬18頭，體質(zhì)量為25～30 kg，由瑞典隆德大學(xué)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了隆德大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在隆德大學(xué)心胸外科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2藥品和溶液Krebs-Ringer緩沖液(含NaCl 119 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5mmol/L，葡萄糖11 mmol/L)；高K+的Krebs-Ringer緩沖液(含KCl 127mmol/L，NaHCO315 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L)；血栓烷A2受體激動(dòng)劑U-46619；P物質(zhì)；罌粟堿。

1.3主要儀器7E型Grass polygraph及FT03D型張力傳感器(美國(guó)Grass Instrument公司)；手術(shù)顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；手術(shù)器械。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 按照隨機(jī)數(shù)表法將18頭豬隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、DCD 30 min組、DCD 40 min組，每組6頭。

1.4.2冠狀動(dòng)脈切取 麻醉后，將氣管切開(kāi)進(jìn)行氣管插管，機(jī)械通氣，吸入氧濃度50%，頻率20次/min，潮氣量250～300 ml，呼氣末正壓5 cm H2O。游離一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)靜脈，穿刺置管行血壓監(jiān)測(cè)及建立靜脈通路。正中開(kāi)胸，打開(kāi)心包，充分暴露心臟，全身肝素化。對(duì)照組直接切取帶周圍組織的冠狀動(dòng)脈后放入4 ℃ Krebs-Ringer緩沖液中，立即在顯微鏡下分離冠狀動(dòng)脈并行器官浴槽實(shí)驗(yàn)。DCD 30 min組和DCD 40 min組行下腔靜脈插管，排空血液后不做任何操作，待30 min和40 min后分別切取帶周圍組織的冠狀動(dòng)脈放入4 ℃ Krebs-Ringer緩沖液中，并立即使用同樣的方法分離冠狀動(dòng)脈進(jìn)行器官浴槽實(shí)驗(yàn)。

1.4.3冠狀動(dòng)脈環(huán)的制作 各組均應(yīng)用手術(shù)顯微鏡及顯微器械，遵循無(wú)創(chuàng)分離的原則，游離冠狀動(dòng)脈前降支遠(yuǎn)端1/3血管(外徑1.0～1.5 mm)，截成2～3 mm的血管環(huán)。

1.4.4冠狀動(dòng)脈功能測(cè)定 ①器官浴槽的容積為5 ml，內(nèi)盛有37.0 ℃的Krebs-Ringer緩沖液，持續(xù)通以體積分?jǐn)?shù)95%的O2和體積分?jǐn)?shù)5%包含CO2的混合氣體，維持Krebs-Ringer緩沖液的pH在7.4左右。浴槽周圍空腔持續(xù)循環(huán)37.0 ℃恒溫水浴鍋加熱的蒸餾水以維持系統(tǒng)恒溫。浴槽內(nèi)的溶液每15 min更換1次。②將血管環(huán)懸掛于浴槽內(nèi)的兩個(gè)L型金屬掛鉤上，一端連接7E型Grass polygraph與張力傳感器在電腦上記錄數(shù)據(jù)，另一端可反復(fù)移動(dòng)調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈環(huán)位置以調(diào)節(jié)其張力維持在基礎(chǔ)張力。③待血管張力穩(wěn)定后，先以高K+Krebs-Ringer緩沖液置換浴槽內(nèi)液體，待收縮達(dá)峰值后，用Krebs-Ringer緩沖液洗滌血管環(huán)到基礎(chǔ)張力。重復(fù)上述步驟1次。待血管環(huán)基礎(chǔ)張力穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入50 μl濃度為5.7×10-7mol/L的U-46619誘導(dǎo)血管環(huán)預(yù)收縮，待收縮達(dá)到平臺(tái)期后，用Krebs-Ringer緩沖液換洗浴槽內(nèi)的液體，至血管環(huán)恢復(fù)基礎(chǔ)張力。再次加入同劑量、同濃度的U-46619誘導(dǎo)第2次收縮，記錄穩(wěn)定時(shí)的張力值，即預(yù)收縮值。④當(dāng)血管環(huán)收縮達(dá)預(yù)收縮值并穩(wěn)定后，依次加入50 μl濃度從10-10～10-4mol/L梯度遞增的P物質(zhì)誘導(dǎo)EDR。觀察并記算各濃度下P物質(zhì)誘導(dǎo)舒張值占預(yù)收縮值百分比、EDRmax、pEC50。最后加入50 μl的罌粟堿(10-4mmol/L)誘導(dǎo)完全舒張。

2 結(jié)果

2.1冠狀動(dòng)脈環(huán)內(nèi)徑基礎(chǔ)張力下，對(duì)照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑分別是(1.37±0.08)、(1.43±0.07)、(1.35 ±0.12)mm，3組冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.837，P>0.05)。

2.2EDR3組EDRmax以及pEC50比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組EDRmax、pEC50比較

3 討論

近年來(lái)，可用于移植的器官數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定而等待移植患者數(shù)量的持續(xù)增加使DCD供體可行性成為新的研究熱點(diǎn)[6]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)DCD供心可行性給出了肯定的答案，但是心臟耐受熱缺血時(shí)間的上限仍無(wú)定論[7-10]。Dhital等[7]成功地使用DCD供心完成3例移植手術(shù)，供體熱缺血時(shí)間分別為28、25、22 min，術(shù)后心功能恢復(fù)正常；Iyer等[8]對(duì)DCD供心體外灌注保存液，觀察到熱缺血時(shí)間30 min的供心功能可完全恢復(fù)，熱缺血時(shí)間40 min的供心功能部分恢復(fù)；Osaki等[9]證實(shí)熱缺血時(shí)間低于40 min的DCD供心具有和腦死亡供心一樣的恢復(fù)潛能。這些實(shí)驗(yàn)研究都給DCD供心的臨床使用可能性提供了依據(jù)。

DCD供心的損傷主要來(lái)自于熱缺血，在器官獲取時(shí)不可避免的熱缺血過(guò)程對(duì)供心損傷的程度及損傷能否被修復(fù)等方面的擔(dān)憂是阻礙DCD供體應(yīng)用的原因[10]。暴露在熱缺血過(guò)程中的心臟由于缺氧、低灌注及能量代謝紊亂等，可對(duì)心肌功能和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能產(chǎn)生損傷。在器官移植及移植后一段時(shí)期內(nèi)，血管內(nèi)皮功能對(duì)移植物的存活和功能恢復(fù)起決定性的作用[11]。通過(guò)浴槽實(shí)驗(yàn)測(cè)定EDR可以實(shí)現(xiàn)對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的評(píng)估。本研究通過(guò)失血法建立DCD模型，3組EDRmax以及pEC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示熱缺血30 min和40 min對(duì)循環(huán)死亡豬心冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能無(wú)明顯影響。

DCD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｓ檬аɑ蛉毖醴ńⅲ⑶覂煞N模型均可用來(lái)研究DCD供心熱缺血過(guò)程的功能損傷。雖然缺氧法模擬臨床情況，但是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)缺氧的耐受能力不同，缺氧法誘導(dǎo)循環(huán)停止的時(shí)間會(huì)有所差異，可導(dǎo)致心臟的損傷程度不同，實(shí)驗(yàn)變量無(wú)法得到控制，而失血法誘導(dǎo)的循環(huán)停止供體采用迅速排空血液的方法，使心臟不經(jīng)歷負(fù)荷超載相關(guān)的損傷，所以對(duì)移植后心功能的恢復(fù)更有利，但是目前臨床接受度不高。另外，本研究?jī)H關(guān)注了冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮的功能，未關(guān)注熱缺血是否導(dǎo)致心肌功能的損傷，需開(kāi)展進(jìn)一步相關(guān)的研究。

由于豬心的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人具有很大的相似性，所以本研究所得結(jié)果對(duì)于DCD供心的臨床使用具有一定的指導(dǎo)意義。DCD供心的臨床推廣不僅需要新技術(shù)如體外灌注技術(shù)的發(fā)展，還要協(xié)同心肌保護(hù)技術(shù)和移植后藥物治療等的進(jìn)一步研究。

綜上，熱缺血30 min及40 min對(duì)豬心冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能無(wú)明顯損傷，對(duì)循環(huán)停止供體心臟的使用提供了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effectsofdifferentwarmischemiatimeoncoronaryendothelialfunctionofdonorheartsaftercirculatorydeathinpigs

Su Yang1, Qin Guangqi2, Liao Qiuming2, Stig Steen2, Qiao Chenhui1

(1.DepartmentofCardiacSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,LundUniversityHospital, 22594,Sweden)

ObjectiveTo investigate the effects of different warm ischemia time on coronary endothelial function of donor hearts after circulatory death in pigs.MethodsEighteen healthy swedish domestic pigs were randomized into control group, warm ischemia 30 min group, and warm ischemia 40 min group. In the control group, the coronary artery was harvested immediately after sternotomy and pericardiotory. The DCD model was induced by rapid exsanguination and left in situ for 30min in the warm ischemia 30 min group, 40min in the warm ischemia 40 min group. Then endothelium-dependent relaxation of the left anterior descending coronary arteries in the three groups was investigated in organ bath.ResultsThe ratio of maximal EDR to the maximal contraction in control group, warm ischemia 30min group and warm ischemia 40 min group were (95.72±0.95)%, (95.09±0.85)% and (94.41±1.06)%, respectively(P>0.05). The negative logarithm of negative logarithm of half effect concentration (pEC50) were (6.53± 0.07)%, (6.43±0.02)% and (6.38±0.04)%, respectively(P>0.05).ConclusionUnder the circumstances of this experiment, there was no coronary EDR caused by either 30 minutes or 40 minutes warm ischemia injury.

donation after circulatory death; warm ischemia time; endothelial cell; heart transplantation

喬晨暉，E-mail：qchenhui@hotmail.com。

R 654.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.22.002

2017-05-09)