高脂聯合小劑量鏈脲佐菌素建立實驗性2型糖尿病大鼠模型

吳 瑛，張 勇，姚合斌

高脂聯合小劑量鏈脲佐菌素建立實驗性2型糖尿病大鼠模型

吳 瑛，張 勇，姚合斌

目的探討建立具有胰島素抵抗、近似人2型糖尿病特征的SD大鼠模型。方法將36只SD大鼠隨機分為A組(對照組即普通飼料組)6只、B組(高脂飼料組)6只、C組[普通飼料＋小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)組]12只、D組(高脂飼料＋小劑量STZ組)12只共4組。C組、D組大鼠分別在普通飼料和高脂飼料喂養4周后使用小劑量STZ(30 mg/kg)腹腔注射5 d。隨機血糖＞16.7 mmol/L且持續2周為建模成功。結果C組、D組能建立2型糖尿病SD大鼠模型，成模率分別為66.7%(8/12)、91.7%(11/12)。結論高脂飼料＋小劑量STZ發病過程接近自然，成模率更高，模型穩定，是值得推廣的2型糖尿病動物模型。

2型糖尿病；血糖；高脂；鏈脲佐菌素；模型，大鼠

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其慢性并發癥已成為嚴重影響人類健康的全球性公共衛生問題之一。預計到2035年，全球將有近5.92億人患DM[1]，其中2型DM(type 2 DM，T2DM)占90%以上。目前DM的病因及發病機制并未完全闡明，因此建立可靠的動物模型，對T2DM發病機制的研究、治療和預防至關重要。目前復制T2DM動物模型的方法有很多種，如膳食誘導、藥物誘導、基因敲除、自發性模型等[2]，但存在建模時間長、胰島損傷重、經費高、不能完全模擬人類T2DM的發生過程等諸多問題。本研究用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)加高脂飼料誘導建立T2DM大鼠模型，以篩選出更適合建立此模型的STZ劑量和飼料配方，為優化方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠36只，無特定病原體級，體重150～180 g，由第三軍醫大學動物中心[SCXK-(渝)-2016-0004]提供。

1.1.2 飼料 普通飼料由第三軍醫大學實驗動物中心提供。普通飼料含碳水化合物53%、脂肪25%、蛋白質22%；高脂飼料為普通飼料添加10%豬油、1%膽固醇混合加工而成，其中含碳水化合物39%、脂肪42%、蛋白質19%。

2 結果

2.1 成模 C組成模率為66.7%(8/12)、D組成模率為91.7%(11/12)。建模后，T2DM大鼠較正常大鼠逐漸出現進食與水量增多、排尿增多、體重下降、精神委靡、毛色枯黃、形體消瘦等特征。

2.2 體重 建模前各組大鼠體重差異無統計學意義(P＞0.05)；建模后的C組、D組體重明顯低于A組，差異均有統計學意義(t分別為3.257、4.804，P分別為0.009、0.001)，且D組體重下降明顯。見表1。

2.3 隨機血糖 建模前，各組隨機血糖值均在正常范圍(4～6 mmol/L)。建模后，A組、B組隨機血糖值仍維持在正常水平，C組8只、D組11只隨機血糖值維持在16.7 mmol/L以上且持續2周。C組、D組在建模后隨機血糖值高于A組，差異均有統計學意義(t分別為14.290、21.244，P均為0.000)。見表1。

2.4 空腹血糖和胰島素水平 建模后C組、D組空腹血糖高于A組(t分別為16.023、14.290，P均為0.000)，B組空腹胰島素高于A組(t＝2.999、P＝0.013)。見表1。

表1 建模前后大鼠體重、隨機血糖、空腹血糖、空腹胰島素(±s)

表1 建模前后大鼠體重、隨機血糖、空腹血糖、空腹胰島素(±s)

注:與A組比較，?P＜0.01，☆P＜0.05

組別建模前體重(g)隨機血糖(mmol/L)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)建模后體重(g)隨機血糖(mmol/L)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)A組(n＝6)261.86±30.524.99±0.224.98±0.659.85±4.37342.67±57.775.36±2.525.10±0.1612.32±1.66 B組(n＝6)295.71±75.255.03±0.315.33±0.5811.73±4.16361.90±25.017.42±3.235.27±0.2115.23±3.78☆C組(n＝12)259.22±41.064.63±0.514.92±0.4110.64±5.32301.30±40.63?19.30±2.65?18.15±2.23?10.93±4.21 D組(n＝12)290.62±56.004.18±0.545.37±0.8011.85±5.24283.80±33.66?32.30±3.98?26.27±2.65?13.12±2.11

3 討論

理想的DM動物模型應該具有相似的發病誘因、發病過程和臨床特征，高血糖動物模型是否能在一定程度上代表臨床T2DM的病理特征，是評判動物實驗模型成功的關鍵。本研究將高脂飲食與STZ干預相結合，采用成年SD大鼠高脂喂養1個月后，產生胰島素抵抗，再給予小劑量STZ腹腔注射成功誘導出病理、生理改變接近于人類的T2DM模型。

3.1 實驗動物的選擇 目前國內外對DM動物模型的研究很多，常根據不同的實驗目的選擇不同的動物，國內臨床研究采用最多的是SD、Wistar大鼠。由于大鼠在建模過程中會出現多飲、多食、多尿及體重明顯減輕等DM癥狀，SD大鼠與Wistar大鼠相比病死率低，抵抗力更強[3]，且少見自發緩解現象[4-5]，因此本實驗選用了無特定病原體級的成年SD大鼠作為研究對象。

3.2 方法的選擇 由于單純高脂飼料喂養周期長，飼料成本較高，因此許多研究都選擇藥物聯合誘導的方法；然而藥物誘導DM模型也因藥物選擇、給藥方式、給藥劑量的不同，其成模效果也不同。給動物大劑量注射四氧嘧啶或STZ后破壞胰島細胞，導致胰島素分泌障礙，比較符合1型DM特征；多次小劑量注射STZ、高脂飲食＋小劑量STZ聯合使用誘發DM模型比較符合T2DM特征[6-7]。本實驗采取高脂飲食＋小劑量STZ腹腔注射，對組織毒性小，動物存活率高，且更好地模擬了人類DM的發生過程；實驗結果也顯示，高脂飲食可使大鼠體重明顯增加，形成胰島素抵抗，再給予小劑量STZ血糖明顯升高且保持穩定水平，成模率較高。在注射部位選擇上本實驗采取腹腔注射，方法易于掌握，避免了靜脈注射中因用藥過量和速度過快導致心力衰竭[8]，注射部位固定也可保證成模后血糖數據的穩定性[9]。

3.3 注射劑量的確定 關于STZ的用量，很多研究報道不一，小劑量一般在25～40 mg/kg、大劑量一般在50～70 mg/kg[10-13]，病死率也隨著用藥劑量的增大而增高[13]。反復小劑量或大劑量一次性注射易造成胰島細胞直接損傷，比較了有關文獻報道后本實驗選擇30 mg/kg的劑量；實驗結果也顯示，此劑量條件下成模大鼠血糖值和胰島素水平明顯升高，具有胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血癥的T2DM臨床特征。

3.4 成模標準的確定 關于DM大鼠成模水平的判斷，目前國內外的研究對DM模型判定標準不一，大多數研究傾向于空腹血糖＞7.8 mmol/L或隨機血糖≥16.7 mmol/L[14-15]。由于空腹時間大于12 h，易造成低血糖且容易造成DM癥狀較重的大鼠死亡，因此選擇隨機血糖更為靈活、操作性更強。為了避免病情自發緩解的問題，分別在建模后第3、7、14天測定血糖，以建模后14 d隨機血糖仍維持在16.7 mmol/L以上作為模型成功的標志，確保了模型的穩定性。

DM是一種由代謝系統紊亂引起的內分泌疾病，其主要發病機制為胰島素相對不足且伴隨有胰島素抵抗。本研究在借鑒前人研究的基礎上將高脂飲食與STZ干預相結合，采用成年SD大鼠高脂喂養聯合小劑量STZ腹腔注射的方法誘導實驗鼠出現多飲、多食、多尿等DM癥狀，體重明顯下降，血糖明顯升高且出現胰島素抵抗，其病理、生理改變接近于人類T2DM模型，具有時間短、成模率高、血糖水平穩定的特點，是值得推廣的T2DM模型。

[1]Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA，2013，310(9):948-959.

[2]婁偉成，宣金，吳賽華，等.2型糖尿病大鼠模型研究概況[J].中國中醫藥咨訊，2011，3(18):88-90.

[3]農慧，盛慶壽，梁健，等.STZ誘導糖尿病大鼠模型的研究[J].廣西醫科大學學報，2010，27(1):69-72.

[4]余嬌，王繁麟，徐兵，等.卡托普利對糖尿病腎病大鼠血漿同型半胱氨酸和腎功能的影響[J].解放軍醫藥雜志，2016，28(5):28-31.

[5]陳欣，文武，郁正亞.高糖高脂飼料聯合小劑量鏈脲佐菌素制備SD大鼠2型糖尿病模型[J].中國醫藥導刊，2015，17(5):737-738，740.

[6]湯球.2型糖尿病大鼠模型的制備與評價[J].四川醫學，2011，32(4):463-465.

[7]祁秀茹，王紅杰.高脂飲食聯合鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病大鼠模型的研究進展[J].河北醫藥，2015，37(21):3308-3310.

[8]殷成坤，劉燕，李曉霞，等.高脂飲食聯合STZ建立2型糖尿病大鼠模型穩定性觀察[J].川北醫學院學報，2016，31(2):178-182.

[9]章成昌，謝光榮，姜玉濤，等.鏈脲菌素制備2型糖尿病大鼠模型的研究[J].安徽醫藥，2012，16(9):1241-1244.

[10]蔣朝暉，呂玉晶，趙芳，等.高脂高糖飲食結合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的改良[J].中國比較醫學雜志，2011，21(1):33-35，44.

[11]Tian ZH，Miao FT，Zhang X，et al.Therapeutic effect of okra extract on gestational diabetes mellitus rats induced by streptozotocin[J].Asian Pac J Trop Med，2015，8(12):1038-1042.

[12]Fukuoka CY，Torres Schr?ter G，Nicolau J，et al.Low-power laser irradiation in salivary glands reduces glycemia in streptozotocin-induced diabetic female rats[J].J Biophotonics，2016，9(11/12):1246-1254.

[13]Afrin R，Arumugam S，Wahed MI，et al.Attenuation of endoplasmic reticulum stress-mediated liver damage by mulberry leaf diet in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Am J Chin Med，2016，44(1):87-101.

[14]黃焱，陳恩玉，陳雅芬，等.鏈脲佐菌素結合高糖高脂飲食誘導2型糖尿病大鼠模型[J].實用醫學雜志，2010，26(13):2299-2301.

[15]王春田，王莉，石巖.糖尿病動物模型制備方法探討[J].實用中醫內科雜志，2011，25(4):27-30.

Study of streptozotocin and high-fat diet inducing type 2 diabetes in a rat model

WU Ying1，ZHANG Yong2，YAO Hebin3
(1.Department of Nutrition，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Chinese People’s Liberation Army 32150，Xinxiang Henan 453000，China；3.Department of Endocrinology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo set up a SD rat model similar to human type 2 diabetes mellitus with insulin resistance.MethodsThirty-six SD rats were randomized into four groups，normal group(group A，n＝6)，high-fat diet group(group B，n＝6)，low-does streptozotocin group[group C，streptozotocin(STZ)，30 mg/kg，n＝12]，and high-fat diet and low-does STZ(30 mg/kg)group(group D，n＝12).Group C and D were induced by an injection of low-does STZ(30 mg/kg)after 4 weeks of normal chow feeding and high-fat chow feeding respectively.Rats with random plasma glucose levels＞16.7 mmol/L for 2 weeks were modeling success.ResultsBoth normal chow feeding associated with low-does STZ(30 mg/kg)and high-fat chow feeding associated with low-does STZ(30 mg/kg)can establish type 2 diabetes animal model.The diabetes morbidity was 66.7%(8/12)in group C，and 91.7%(11/12)in group D.ConclusionGroup D has moderately high blood sugar，insulin resistance，the success rate is high，and can be used as a good model of type 2 diabetes mellitus in relevant research.

Type 2 diabetes mellitus；Blood glucose；High fat；Streptozotocin(STZ)；Model，rat

R587.1－332

A

2095-3097(2017)06-0355-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.009

解放軍總后勤部保健專項課題(CWS14BJ38)

100048北京，海軍總醫院營養科(吳 瑛)；453000河南新鄉，中國人民解放軍32150部隊醫院(張 勇)；100048北京，海軍總醫院內分泌科(姚合斌)

1.1.3 試劑及儀器 STZ(美國Sigma公司)－20℃凍存，檸檬酸、檸檬酸三鈉(天津市津宏化工有限公司)；微量血糖儀及配套血糖試紙(美國強生公司)，BS224S電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模方法

1.2.1.1 用藥及制備 使用檸檬酸和檸檬酸三鈉配制成0.01 mol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖液，4～8℃冷藏保存。使用前用STZ配制成2%的STZ溶液。

1.2.1.2 動物飼養及分組 所有SD大鼠飼養環境為室溫(23±1)℃，明暗周期12 h，相對濕度50%～60%，自由進食、水。適應性飼養1周后隨機分為A組(對照組即普通飼料組)6只、B組(高脂飼料組)6只、C組(普通飼料＋小劑量STZ注射組)12只、D組(高脂飼料＋小劑量STZ注射組)12只4組。

1.2.1.3 給藥途徑和劑量 4組大鼠在分組4周后，禁食、不禁水12 h，測空腹血糖，并同時稱體重。A組、B組大鼠按30 mg/kg注射檸檬酸緩沖液，C組、D組大鼠按30 mg/kg連續5 d腹腔注射2%STZ檸檬酸緩沖液。

1.2.1.4 成模標準 隨機血糖≥16.7 mmol/L且持續2周為造模成功。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 一般狀況 每日觀察各組大鼠進食、飲水、排尿量及死亡情況，每周稱重1次。

1.2.2.2 血清生化指標 建模后分別于第3、7、14天尾靜脈測定血糖。實驗大鼠于處死前空腹12 h禁食、不禁水，測完空腹血糖和體重后乙醚麻醉大鼠，靜脈采血，放射免疫分析法測定空腹胰島素。

1.2.2.3 蘇木精-伊紅染色 大鼠處死后，立即取出骨骼肌組織，放入甲醛溶液中浸泡；肌肉組織石蠟包埋，切片后行蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠骨骼肌組織變化。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2016-12-02 本文編輯:徐海琴)