玉屏風散合四物湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道7種細菌的影響

彭靜+羊忠山++李玉卿++袁嘉麗

[摘要] 目的 觀察玉屏風散合四物湯對慢性阻塞性肺病（COPD）大鼠氣道肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌、乳酸桿菌的影響作用，為玉屏風散合四物湯治療COPD提供一定的實驗依據。 方法 按隨機數字表將50只SPF級雄性Wistar大鼠分為正常組，模型組，玉屏風散合四物湯高、中、低劑量組，每組各10只。通過氣管滴注脂多糖加煙熏的方法建立COPD大鼠模型。造模結束后，給藥組分別給予不同濃度玉屏風散合四物湯灌胃，正常組和模型組以無菌蒸餾水灌胃，每日1次，連續30 d。收集所有大鼠肺組織勻漿進行各種細菌的高通量測序檢測，取左肺組織制作病理切片。 結果 ①與正常組相比，模型組乳酸桿菌含量顯著降低，其余6種細菌含量均顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；②與模型組相比，玉屏風散合四物湯高、中、低劑量組的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌含量顯著降低，高劑量組的流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05），而中、低劑量組差異無統計學意義（P > 0.05）；③與模型組相比，玉屏風散合四物湯低、中劑量組的乳酸桿菌含量顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），而高劑量組差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 玉屏風散合四物湯可使COPD大鼠肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量明顯減少，乳酸桿菌含量增多，這可能是其治療COPD的重要機制之一。

[關鍵詞] 玉屏風散；四物湯；慢性阻塞性肺疾病；細菌

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0013-04

Effects of Yupingfeng San and Siwu Decoction on seven kinds of bacteria in rats with chronic obstructive pulmonary disease

PENG Jing YANG Zhongshan LI Yuqing YUAN Jiali

Basic Medical College， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Yunnan Province， Kunming 650500， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Yupingfeng San and Siwu Decoction on Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa， Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus， Neisseria and Lactobacillus in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）， in order to provide experimental basis for Yupingfeng San and Siwu Decoction in the treatment of COPD. Methods Fifty SPF male wistar rats were divided into 5 groups， incliding normal group， model group， Yupingfeng San and Siwu Decoction high dose， middle dose and low dose groups， with 10 cases in each group. The COPD rat model was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide plus smoked methods. After molding， the rats in the dose groups were given to different concentrations of Yupingfeng San and Siwu Decoction by gavage， while the rats in the normal group and model group were fed with sterile distilled water， once time a day for 30 days. All the lung tissues of rats were collected， to for high-throughput sequencing of various bacteria， and the left lung tissue was used to make pathological sections. Results ①Compared with the normal group， the content of Lactobacillus in the model group was significantly decreased， and the contents of the other six bacteria were significantly increased， with statistically significant difference （P < 0.05）.②Compared with model group， the contents of Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa in the Yupingfeng San and Siwu Decoction high， middle and low dose groups were significantly reduced， the contents of Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus， Neisseria in the high dose group were significantly reduced， with statistically significant difference （P < 0.05）， but there was no significant difference between the middle and low dose groups （P > 0.05）.③The contents of Lactobacillus in the Yupingfeng San and Siwu Decoction low and middle dose groups was significantly increased， compared with model group， with statistically significant difference （P < 0.05）， there was no significant difference between high dose group and model group （P < 0.05）. Conclusion The contents of Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa， Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus and Neisseria can be significantly reduced in rats with COPD by Yupingfeng San and Siwu Decoction， the content of Lactobacillus increasing， which may be one of the important mechanisms for the treatment of COPD .endprint

[Key words] Yupingfeng San； Siwu Decoction； Chronic obstructive pulmonary disease； Bacterial

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的呼吸系統疾病，嚴重危害患者的身心健康，其氣流受限不完全可逆、呈進行性發展，與肺對吸入煙草煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎性反應有關[1]。很多研究表明，細菌定植與COPD的發病及加重密切相關，有效控制細菌感染是治療COPD的重要手段之一[2-4]。

玉屏風散為中藥免疫調節劑，具有益氣固表止汗之效[5-8]，四物湯是活血養血法的經典方劑，功效養血調血，主治營血虛滯證[9-11]。兩方合用則有“益氣活血養血”之效，經臨床治療300余例COPD，顯效率為80%以上。因此本實驗選定玉屏風散合四物湯干預COPD大鼠氣道7種常見細菌，觀察其影響效果，分析其治療COPD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與藥材

50只雄性SPF級Wistar大鼠，6～8周，平均體重（200±20）g，購于成都達碩生物科技有限公司[動物許可證號SCXK（川）2015-030]，飼養于云南中醫學院（以下簡稱“我校”）實驗動物中心。玉屏風散合四物湯（黃芪、白術、防風、熟地、當歸、白芍、川芎7味中藥組成），均購自云南鴻翔中藥科技有限公司（生產批號：20160803），由我校中藥鑒定教研室鑒定其品種和質量。全方生藥總量122 g，以成人每日治療劑量根據大鼠體表面積換算為其等效劑量[10.98 g/（kg·d）]，此劑量作為中劑量組，低、中、高劑量的比例為0.5∶1∶3。

1.2 試劑及儀器

紅塔山牌香煙（煙堿量1.1 mg/支，焦油量11 mg/支，一氧化碳量11 mg/支，云南玉溪卷煙廠生產），脂多糖（LPS，10 mg/支，Sigma公司），石蠟切片機（Leica RM2235，德國徠卡），攤片機（Leica HI1210，德國徠卡），顯微鏡（CI-L型，日本尼康）。

1.3 動物分組及模型制備

SPF級雄性Wistar大鼠普通飲食、飲水，適應性飼養1周后，按隨機數字表分為5組，每組各10只，分別為正常組，模型組和玉屏風散合四物湯高、中、低劑量組。除正常組外，其余4組分別于第1、14日向各實驗組大鼠（10%水合氯醛腹腔注射麻醉）氣管內注入脂多糖200 μL，第2～28天（注射LPS當天除外）上午將大鼠置入自制密閉的有機玻璃箱內，注入5%（V/V） 紅塔山牌香煙煙霧，30 min /d，共28 d（4周）。正常組不予煙熏，但采用相同的方法氣管內滴入等量的生理鹽水。

1.4 給藥方法

造模結束后，每日灌胃給藥1次，連續給藥30 d。正常組和模型組以無菌蒸餾水灌胃。

1.5 指標檢測

給藥結束后的第2天殺鼠取材，無菌條件下取出右肺放入液氮凍存備用，所有標本均用肺組織勻漿進行各種細菌的高通量測序檢測，取其左肺組織制作病理切片。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺組織病理切片比較

正常組大鼠肺組織氣道結構清晰，支氣管管腔規則，氣道內未見黏液分布及黏液栓形成，氣道纖毛上皮排列整齊，黏膜皺襞無水腫，未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡腔內未見炎癥細胞及滲出液。模型組大鼠肺內細支氣管周圍有大量炎癥細胞浸潤，肺間質及細支氣管壁可見炎癥細胞浸潤，氣道結構紊亂，支氣管黏膜皺襞減少，甚至脫落，管腔狹窄，氣道壁可見大量纖維組織增生，管壁增厚，氣道纖維化，肺泡腔明顯擴張，部分肺泡腔融合。玉屏風散合四物湯高、中、低劑量組表現比模型組減輕，中劑量組改善尤為明顯（圖1）。

2.2 各組大鼠7種細菌含量比較

由于實驗過程中操作不當導致部分大鼠死亡，正常組、模型組、玉屏風散合四物湯高劑量組、玉屏風散合四物湯中劑量組分別死亡1、2、1、2只，玉屏風散合四物湯低劑量組大鼠無死亡。與正常組相比，模型組乳酸桿菌含量顯著降低，其余6種細菌含量均顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組相比，玉屏風散合四物湯高、中、低劑量組的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌含量顯著降低，高劑量組的流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05），而中、低劑量組差異無統計學意義（P > 0.05）；與模型組相比，玉屏風散合四物湯低、中劑量組的乳酸桿菌含量顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），而高劑量組差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

3 討論

細菌負荷增高可以導致COPD慢性氣道炎癥加重，因此，降低細菌的定植量能有效緩解COPD的炎癥程度。本實驗選取的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌屬于COPD檢出率較高的病原菌。趙淑敏等[12]收取了278例COPD合并肺部感染患者的痰液，觀察細菌培養及藥物敏感性，結果顯示COPD合并肺部感染主要為銅綠假單胞菌（22.13%）、腸桿菌屬（14.50%）、流感嗜血桿菌（13.74%）、肺炎克雷伯桿菌（12.21%）等革蘭陰性桿菌。

腸桿菌屬是革蘭陰性菌，廣泛分布于自然界，普遍存在于人和動物中。最常見的兩種是產氣腸桿菌和陰溝腸桿菌，能引起多種腸道外的條件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和傷口感染，亦可引起菌血癥和腦膜炎[13]。

醫學上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌等，其中，與COPD密切相關的主要是肺炎鏈球菌，許多文獻報道COPD患者肺炎鏈球菌檢出率明顯增高[14-15]。endprint

奈瑟菌屬包括腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌、淺黃奈瑟菌、黏液奈瑟菌等。易旭等[16]的研究表明，奈瑟菌在抗菌藥物治療過程中被篩選，從而成為患者呼吸道感染的主要致病菌。

乳酸桿菌是一群生活在機體內益于宿主健康的微生物，它維護人體健康和調節免疫功能的作用已被廣泛認可。該類細菌絕大多數對動物和人無毒、無害，負擔著動物體內重要的生理功能。

玉屏風散由黃芪、白術、防風組成。黃芪多糖是黃芪的主要生物活性成分，其對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌和綠膿桿制有抑菌作用[17]。白術、防風具有抑制星形奴卡菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌等的作用[18-19]。四物湯包括熟地、當歸、川芎、白芍，全方及組方對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌均有較強的抑制作用[20]。

本實驗結果顯示模型組肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌的含量均顯著升高，而乳酸桿菌含量顯著降低，說明在COPD狀態下發生了一定程度的菌群紊亂，應用玉屏風散合四物湯干預后能有效降低6種細菌的含量，對乳酸桿菌則有升高作用，說明此方減輕了這6種病原菌的定植程度，并提升了益生菌的含量，使之能發揮拮抗病原微生物、調節免疫等益生性能，這可能是其治療COPD的作用機制之一。

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（收稿日期：2017-09-15 本文編輯：李岳澤）endprint