豫南地區副豬嗜血桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

余洪濤，馬超鋒

（1.淮濱縣畜產品檢驗檢測中心，河南 信陽 464400；2.信陽市動物疫病預防控制中心，信陽 464000）

豫南地區副豬嗜血桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

余洪濤1，馬超鋒2

（1.淮濱縣畜產品檢驗檢測中心，河南 信陽 464400；2.信陽市動物疫病預防控制中心，信陽 464000）

2014年5月至2015年12月對河南省信陽、駐馬店等地部分豬場出現疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬進行病理剖檢、細菌分離培養、PCR鑒定、血清型鑒定和藥敏試驗。結果表明，14株副豬嗜血桿菌分屬3個血清型，其中血清4型7株，5型4株，12型2株，未定型1株；藥敏試驗結果顯示，14株副豬嗜血桿菌對環丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟高度敏感，對替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素和氟苯尼考中度敏感，對林可霉素、慶大霉素、鏈霉素均耐藥。

副豬嗜血桿菌；分離鑒定；血清型；藥敏試驗

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起的豬的多發性漿膜炎和關節炎，主要臨床癥狀為發熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟失調和被毛粗亂等[1]，最終造成肥育豬、保育豬的死亡和母豬流產。該病全年均可發生，主要發生于5～8周齡豬，發病率在15%左右，死亡率不等，嚴重時死亡率可達50%以上[2]，在規模豬場多發，混合感染豬瘟、豬藍耳病等時引起豬只大量死亡，給豬場帶來較大的經濟損失。

副豬嗜血桿菌血清型復雜多樣，目前至少可以分為 15 種血清型[3-4]，其中血清型 4、5、13最為常見[5]，另有20%以上的菌株血清型不可定型[1]；各型血清型之間的致病力也存在較大差異，其中 1、5、10、12、13、14型毒力最強，其次是 2、4、8、15 型，3、6、7、9、11 型毒力較弱；另外，菌株所在的地域不同，血清型的分布差異也較大[6]。筆者歷時近兩年在河南省部分地區豬場采集病料進行副豬嗜血桿菌的分離鑒定工作，并進行藥敏試驗篩選敏感藥物，以期為該病的防控提供指導。

1 材料

1.1 病料收集

2014年5月至2015年12月，分別在豫南地區的信陽、駐馬店部分豬場收集疑似感染HPS且HPS正向間接血凝試驗（IHA）抗體陽性的病死豬鼻拭子、心血、肝臟、脾臟、肺臟、心包積液、關節液等病料77份，無菌采集。

1.2 主要試劑及培養基

副豬嗜血桿菌分型血清1～15型、金黃色葡萄球菌，由河南農業大學微生物實驗室惠贈；副豬嗜血桿菌正向間接血凝診斷試劑盒，購自蘭州獸醫研究所；革蘭氏染色試劑、普通Taq聚合酶、10×緩沖液、dNTP、DL 2 000 DNA Marker、瓊脂糖等購自大連寶生物工程有限公司；藥敏紙片（部分自制）、NAD、胰大豆瓊脂（TSA和TSB）、胎牛血清（使用前經56℃滅活30 min）、血瓊脂平板、巧克力瓊脂培養基等購自鄭州安圖綠科生物公司；DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中副豬嗜血桿菌的16S rRNA保守區基因序列，用Oligo6.0軟件設計1對引物，預期PCR擴增核酸片段大小分別為814 bp，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物，P1：5′-GTTCTTTCGGTGATGAGGAA-3′；下游引物，P2：5′-GTAGCCCTACTCGTAGGGCCA-3′[7]。

1.4 主要儀器

PCR儀（德國biometre公司）；電泳儀、凝膠成像系統（以色列DNA公司）；5424R高速臺式冷凍離心機（德國eppendorf公司）；HH數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇晶玻實驗儀器廠）；SPX-150B智能型生化培養箱（上海瑯軒實驗設備有限公司）。

2 方法

2.1 細菌的分離培養與純化

從疑似感染HPS的豬病料中取樣，樣品表面、剪刀和鑷子用酒精燈進行消毒后，取病變深層組織，畫線接種于巧克力瓊脂平板和TSA培養基（含有NAD和胎牛血清）上，于37℃培養24～48 h后觀察。挑取典型菌落再在含有NAD和胎牛血清的TSB培養基中進行純培養。將分離細菌接種于鮮血瓊脂平板上，金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，置37℃培養箱中培養24～48 h后觀察是否有“衛星現象”。

2.2 染色鏡檢

將分離出的純培養菌落涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察。

2.3 PCR鑒定

參照筆者建立的副豬嗜血桿菌PCR快速檢測技術操作[7]。

模板DNA的制備：無菌條件下，將疑似副豬嗜血桿菌病料接種于巧克力平板，37℃恒溫培養24 h，驗純后每個平板用6 mL生理鹽水洗脫菌落，取2 mL菌液備用。利用直接煮沸法提取菌株模板DNA，分別取2 mL菌液，10 000 r/min離心5 min，棄去上清液；用雙蒸水溶解沉淀，100℃煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min；收集上清液，置于4℃待用或-20℃長期保存。

PCR 擴增：總 PCR 反應體系 25 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1.8 μL（20 pmol/L），上下游引物各 0.6 μL（20 μ mol/L），Ex Taq 0.25 μL，ddH2O 17.25 μL，2 μL DNA模板。反應條件：95℃預變性5 min；95℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環 35次，72 ℃延伸10 min。取PCR產物5 μL，經1%瓊脂糖電泳觀察結果；4℃保存。將陽性樣品的擴增產物送上海生工測序，將測序結果進行同源性比較。

2.4 HPS血清分型

用生理鹽水將菌落從巧克力平板上洗下。使用HPS標準分型血清，按照KRG瓊脂擴散血清分型方法對分離菌株進行血清學分型。

2.5 藥敏試驗

采用紙片法測定HPS分離株對林可霉素、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、環丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟、氟苯尼考等10種藥物的敏感性，并根據抑菌圈的直徑（Φ）判定藥物的敏感性：Φ≥20 mm為高度敏感、15 mm≤Φ＜20 mm為中度敏感、Φ＜15 mm為耐藥。

3 結果

3.1 細菌分離、染色鏡檢結果

從77份疑似病料中分離出14株疑似副豬嗜血桿菌菌株，從外觀形態看，培養基中可見針尖大小、圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊無色透明或灰白色半透明的菌落。革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察，可見兩極濃染的革蘭氏陰性短小桿菌，無芽孢，可見莢膜。在鮮血瓊脂平板上呈現出典型的“衛星生長”現象，初步判為副豬嗜血桿菌。

3.2 PCR反應結果

對細菌分離初步判定的菌株，經PCR鑒定后在814 bp出現特異性的目的條帶，與預期相符，表明所分離到的14株菌均為副豬嗜血桿菌，陽性率18.2%。本試驗擴增的陽性樣品的測序結果與已發表的HPS菌株16S rRNA基因序列同源性達到98%以上。

3.3 副豬嗜血桿菌血清學分型

由表1可以看出，本次共分離出14株副豬嗜血桿菌：信陽株12株，其中血清4型5株，5型4株，12型2株，未定型1株；駐馬店株2株，均為血清4型。

表1 不同地區HPS血清型分布

3.4 藥敏試驗結果

由表2可知，14株副豬嗜血桿菌對環丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟高度敏感，對替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素和氟苯尼考中度敏感，而對林可霉素、慶大霉素、鏈霉素均耐藥。

表2HPS藥敏試驗結果 mm

4 討論

細菌分離培養和染色鏡檢是從形態學上觀察細菌、初步鑒定細菌的重要手段。本研究利用建立的PCR方法對形態學上初步判定為HPS的菌株進一步鑒定，提高了工作效率和準確性。本研究中，從77份疑似感染HPS的病料中分離出14株HPS，分離的菌株經PCR鑒定和測序，均為副豬嗜血桿菌。隨后筆者采用經典的瓊脂擴散（KRG）血清分型方法對14株菌株進行血清分型，強毒力菌株6株，即5型4株、12型2株，中等毒力7株，均為4型，未定型1株，基本摸清河南省豫南地區副豬嗜血桿菌流行的血清型，為疫苗使用和疫病防治提供重要參考。

近年來，副豬嗜血桿菌對豬場危害日益增大，特別是和豬圓環病毒病、豬偽狂犬病、豬藍耳病等混合感染時，危害加劇。養殖場防控HPS感染，大多采用預防性投藥，如替米考星、氟苯尼考、泰樂菌素等，由于耐藥菌株的出現，防控效果不是很好。本研究開展了HPS藥敏試驗，采用10種常用藥物對分離的HPS菌株進行耐藥性試驗，篩選出高敏的環丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻肟等3種藥物，可以進行副豬嗜血桿菌的防治。除采用常規藥物防治外，防控副豬嗜血桿菌病還需采用綜合性防控措施：①加強對養殖場生物安全管理。豬舍和場地定期消毒，嚴格人員和車輛出入、并做好登記和消毒；②改善飼養管理。天氣突變、轉群等應激因素發生時，要在豬飼料和飲水中添加保健性、抗應激的藥物如黃芪多糖、電解質多維等，提高豬群應對環境的能力[8]；③疫苗預防。疫苗的使用和預防是防控副豬嗜血桿菌的最有效方法之一，由于不同血清型菌株之間的交叉保護率很低，可以根據當地流行菌株委托有資質的大學或科研院所制備自家滅活疫苗，可以有效控制副豬嗜血桿菌病的發生。

[1] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].第5版.北京：中國農業出版社，2006：264-265.

[2] 伊秀鳳，姜平，鄧雨修，等.副豬嗜血桿菌的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫，2004，36（7）：6-8.

[3] Rafiee M,Blackall P J.Establishment,validation and use of the Kielstein-Rapp-Gabrielsonseroty Ping scheme for Haemophilus Parasuis[J].Anst Vet J,2000,78(3):172-174.

[4] Blackall P J,Rapp-gabrielso V J,Hampson D J.Serological characterisation of Haemophilus parasuis isolates from Anstralianpigs[J].Aust Vet J,1996,73(3):93-95.

[5] 蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養和血清型鑒定[J].華中農業大學學報，2005，24（1）：55-58.

[6] 周斌，儲岳峰，李超，等.華東地區副豬嗜血桿菌的分離、血清型鑒定與藥敏分析[J].畜牧與獸醫，2009，41（11）：84-86.

[7] 馬超鋒，余洪濤，彭燕，等.副豬嗜血桿菌PCR檢測方法的建立與應用[J].畜牧與獸醫，2017，49（2）：89-93.

[8] 李靜，崔寶剛，李東嬌，等.規模化豬場副豬嗜血桿菌病的綜合防控[J].黑龍江畜牧獸醫，2011，12（24）：78-79.

辛辣讓低鹽食品更具咸味

【美國石英財經網站10月31日報道】試圖控制食鹽攝入量的人可能該看看不起眼的墨西哥胡椒。本周發表在美國心臟病協會《高血壓》雜志上的一項新研究成果顯示，幾乎所有辛辣食物都可能影響到一個人所攝入的食鹽量。這是因為鹽和辣椒似乎都能激活大腦中相同區域的腦部活動，并提高對這兩者中任一種的敏感度。

中國重慶第三軍醫大學的研究人員詢問了606名當地成年人的口味偏好，并測量了研究參與者的血壓。他們發現，喜歡吃辛辣食物的人總體而言血壓更低一點，而且吃鹽更少。

隨后，研究人員又利用腦部成像技術觀察了參與者的島葉皮質和眼窩前額皮質，此前的研究都表明當一個人吃咸的食物時會激活這兩個區域。他們發現，這些區域也會被辛辣食物激活，而且辛辣對咸味感受有增強作用。因此，這項研究認為，辛辣食物可能讓人們對鹽更敏感，讓他們能夠像通常情況下吃更咸的食物時那樣享用低鹽食物。

對于面臨高血壓、心臟病和中風等與食用太多鹽相關的健康問題風險的人來說，這一發現或許非常重要。

該研究的其中一名作者朱志明在一份聲明中說：“如果做飯時加一些辣椒，那么不用太多鹽也能做出味道不錯的飯菜。確實，說到吃辣，習慣和個人愛好很重要，但在食物中添加少量并逐步增加一些辣椒會對健康有好處。”

（轉自 參考消息[N]，2017-11-03）

Isolation,Identification and Drug Sensitivity of Test of Haemophilus Parasuis of Southern Region Henan Province

YU Hongtao1,MA Chaofeng2
(1.Huaibin Animal Products Inspection Center,Xinyang 464400,China;2.Xinyang Animal Disease Control and Prevention Center,Xinyang 464000,China)

The paper conducted pathological examination,bacterial isolation culture,PCR identification,serum strain identification and drug susceptibility test for the sick pigs suspected of being infected with Haemophilus from some pig farms of Xinyang,Zhumadian,from May 2014 to December 2015.The results showed that there were 3 serotypes of the 14 strains of Haemophilus parasuis,including 7 strains of serum 4,4 strains of serum 5,2 strains of serum 12 and unformed 1 strain;the results of drug sensitivity test indicated that 14 isolated bacterium were highly sensitive to ciprofloxacin,enoxacin and cefotaxime,and its were moderatesensitive to dimitroxacin,sulfadiazine and erythromycin fluphenicol.But its were resistant to lincomycin,gentamicin and streptomycin.

Haemophilusparasuis;isolation and identification;serotype;drug sensitivity test

S858.282.61+2

A

1002-1957(2017)06-0116-03

2017-11-10

信陽學院校級重點科研項目（2017zd02）

余洪濤（1974-），男，河南淮濱人，獸醫師，主要從事動物疫病防治工作.E-mail:464977965@qq.com

馬超鋒（1981-），男，河南禹州人，高級獸醫師，碩士，主要從事動物疫病防控工作.E-mail:machaofeng5@163.com

（編輯：富春妮）