一例豬圓環病毒3型病料的PCR檢測

魏 鳳，李 峰，張文通，苗立中，沈志強，

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

一例豬圓環病毒3型病料的PCR檢測

魏 鳳1，李 峰1，張文通2，苗立中1，沈志強1，2

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

為弄清引起山東省沾化縣某養豬場病豬多系統衰竭綜合征的病原，采用PCR檢測及序列測序分析，確診病原含有豬圓環病毒3型。這個病例的確診，顯示該區域有豬圓環病毒3型的流行，為當地防疫部門開展針對該病防控提供理論依據。

豬圓環病毒3型；PCR；檢測

2015年6月，研究人員從美國北卡羅萊納州某養豬場利用宏基因組測序技術發現了一種新型豬圓環病毒，即豬圓環病毒3型（porcine circovirus type 3,PCV3）[1]。2016年至今，我國多個研究機構如華中農業大學動物傳染病研究室、華南農業大學國家生豬育種工程中心、山東農業科學院畜牧獸醫研究所等都報道了豬圓環病毒3型在我國流行的情況[2]。

PCV3基因組有2 000個堿基組成，主要編碼Cap和Rep兩個基因。PCV3 Cap基因編碼214個氨基酸殘基，Rep基因編碼297個氨基酸殘基[3]。PCV3 Cap基因編碼的氨基酸殘基較PCV2少19~20個。PCV3毒株主要分為3a和3b兩群，其中3a和美國報道PCV3毒株處于同一進化分支[4]。

目前研究表明，PCV3在我國豬場抗原陽性率高達12.7%，而血清陽性率高達48.02%[4]。PCV3對豬致病性及PCV2疫苗能否阻止PCV3的侵襲已成為從事生豬疫病研究人員迫切需要研究的課題。筆者于2017年9月10日，利用PCR及測序，確診了從山東省沾化縣某豬場送檢濱州畜牧獸醫研究院門診的病死豬組織中含有PCV3。

1 材料與方法

1.1 病料

山東省沾化縣某豬場病死豬（約60日齡）肺臟及腹股溝淋巴結。

1.2 主要試劑

病毒DNA基因組提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、pMD18-T、BamHI、HindШ 載 體 均購自寶生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；DH5a菌種由濱州畜牧獸醫研究院保存。

1.3 引物設計與合成

參照文獻[5]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCV3檢測引物，PCR擴增核苷酸預期為338 bp。引物序列為：P1：5′-CCACAGAAGGCGCTAT GTC-3′，P2：5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′。

1.4 PCV3的PCR鑒定

將無菌采集的病料組織，按照1∶3比例添加滅菌的0.85%氯化鈉水溶液，用勻漿器進行研磨；懸液反復凍融3次；然后以12 000 r/min離心處理；離心的上清液用0.22 μm濾器過濾除菌并保存備用。過濾后的菌液一部分用作提取DNA基因組的模板。

取部分濾液用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體操作按試劑盒說明書進行。以該基因組為模板，用P1和P2引物進行PCR擴增。PCR擴增 25 μL 體系，具體為：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（20 mmol/L）1 μL、P1 和 P2（引物濃度均 20 μmol/L） 各 0.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、模板DNA 5 μL，添加水至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環后，72℃延伸10 min。擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.5 PCV3的PCR產物克隆及序列分析

將擴增到的PCR產物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，具體操作按試劑盒說明書進行。將回收到的PCR產物，連接到pMD18-T載體上，經BamHⅠ和HindШ雙酶切鑒定正確后，送往上海生物工程有限公司進行測序。用DNAStar軟件對測序結果與GenBank上報道的PCV2基因核苷酸序列同源性進行分析。

2 結果與分析

2.1 PCV3的PCR鑒定結果

疑似PCV3感染病料的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增到了與預期大小338 bp相符的片段，結果見圖1。根據PCR鑒定結果初步判定該豬場的病料為PCV3陽性。

圖1 PCV3的PCR擴增結果

2.2 PCV3的PCR擴增產物測序結果

將鑒定正確克隆質粒送去上海生工測序。測序結果顯示：PCV3的PCR擴增產物338 bp，序列如下：CGACGATTCCACAGAAGGCGCTATGTCAGA AGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGC ACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAAC GTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGC CCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAA CGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTAT AAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTCAGCCCT GTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGT TCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCT GGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTA TGCGGA；將測序結果在 NCBI里進行 Blast，該核苷酸序列與搜索到的其他PCV同源性在97%~99%。

3 討論

利用PCR及測序確診感染PCV3的養豬場來自山東省沾化縣。該養豬場規模50多頭母豬，發病豬零星死亡，多保育階段仔豬死亡。剖檢病變主要為腹股溝淋巴結腫大，切面嚴重出血；肺臟間質性肺炎；腎臟有壞死點。使用多種抗生素治療無效。該豬場未進行PCV2苗的免疫。

下一步工作：一是需要弄清該豬場PCV3的來源；二是跟蹤調查附近區域豬場PCV3流行情況；三是開展PCV3分離及全基因組測序研究。開展下一步工作的同時，需向有關部門通報PCV3的研究結果，以引起豬場及行業主管的重視。

[1] 翁善鋼.一種新的豬圓環病毒—豬圓環病毒3型[J].養豬，2017（4）：64.

[2] 賀會利，李軍，潘艷，等.廣西首例豬圓環病毒3型的發現及其衣殼蛋白序列分析[J].南方農業學報，2017（8）：1499-1503.

[3] 湛洋，王東亮，王乃東，等.豬圓環病毒3型檢測及其Cap結構序列和抗原性預測分析[J].畜牧獸醫學報，2017，48（6）：1076-1084.

[4] 咸文，梁海英，曾智勇，摘譯.豬圓環病毒3型的鑒定與遺傳特征分析[J].豬業科學，2017，34（7）：32-33.

[5] Palinski R,Pi?eyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J/OL].J Virol,2016,doi:10.1128/JVI.01879-16.

PCR Detection for One Case of Porcine Circovirus Type 3

WEI Feng1,LI Feng1,ZHANG Wentong2,MIAO Lizhong1,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Binzhou Animal Science＆Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600,China;2.Shandong LvDu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

To find out pathogen of multisystem failure case from a scale pig farm in Zhanhua county,Shandong Province,the pathogen was diagnosed with porcine circovirus type 3 by polymerase chain reaction diagnosis and sequence sequencing analysis.The diagnosis of this case shows that the area has the prevalence of porcine circovirus 3 and provides a theoretical basis for the prevention and control of the disease in the local epidemic prevention department.

porcine circovirus type 3;polymerase chain reaction;detection

S858.282.65+9.2

A

1002-1957(2017)06-0099-02

2017-10-10

山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊項目（SDAIT-08-17）

魏 鳳（1979-），女，河南遂平人，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究.E-mail:hzndzwt1@163.com

（編輯：富春妮）