豬金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗

龔 岳

（濱海新區(qū)塘沽動物衛(wèi)生監(jiān)督所，天津 濱海新區(qū) 300454）

豬金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗

龔 岳

（濱海新區(qū)塘沽動物衛(wèi)生監(jiān)督所，天津 濱海新區(qū) 300454）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性球形細(xì)菌，顯微鏡下排列成葡萄串狀，無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，是常見的引起食物中毒的致病菌，常見于皮膚表面及上呼吸道黏膜。

金黃色葡萄球菌對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適生長pH 7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1~2 mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10%~15%氯化鈉（NaCl）肉湯中生長。可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性[1]。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。在干燥環(huán)境中可存活數(shù)月；在空氣中存在，但不繁殖。耐熱性強(qiáng)，加熱70℃1 h或80℃30 min不被殺死；耐低溫，在冷凍食品中不易死亡；耐高滲，在含有50%~66%蔗糖或15%以上食鹽食品中才可被抑制。

日常生活中，人之間的接觸或打噴嚏，被貓、狗咬傷等，尤其是豬群大規(guī)模飼養(yǎng)中，如果不注意人和易感動物的交叉感染，都可感染金黃色葡萄球菌。此外，耐藥的金黃色葡萄球菌可能通過食物、水源、毛發(fā)和其他接觸方式傳遞給人，對公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重威脅[2]。

本試驗采集患病豬只患處膿汁、滲出液、傷口分泌物、血液、尿液、糞便等不同樣品，分離培養(yǎng)和鑒定金黃色葡萄球菌，并進(jìn)行生化試驗和藥敏試驗，研究金黃色葡萄球菌對先鋒V、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、青霉素、鏈霉素和紅霉素的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點(diǎn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)與藥敏試驗于2016年9月中旬至9月底在天津農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗室進(jìn)行。

1.2 材料準(zhǔn)備

1.2.1 培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備

（1）將30個培養(yǎng)皿清洗干凈，并用蒸餾水沖洗、晾干。

（2）將培養(yǎng)皿用培養(yǎng)皿滅菌布袋包好，置于160℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中2 h。1.2.2 培養(yǎng)基所需器皿和試劑

（1）器皿：量筒（100 mL）、燒杯（1 000 mL和100 mL各 1個）、漏斗、三角燒瓶（100 mL）、試管、玻璃棒、刻度吸管（1 mL和10 mL各1個）、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、試管塞、包裝紙、扎繩、洗耳球等。

（2）試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條或粉、0.1 mol/L和1 mol/L的氫氧化鈉水溶液、0.1 mol/L和1 mol/L的鹽酸溶液、蒸餾水、家兔血液。

1.3 培養(yǎng)基的制備

1.3.1 普通肉湯培養(yǎng)基的制作

（1）按以下劑量稱取各種試劑置于燒杯中：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，磷酸氫二鉀 1 g，蒸餾水1 000 mL。

（2）將上述成分混合加熱溶解后，以0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)整至pH 7.4~7.6。

（3）將pH測定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過濾。

（4）將過濾好的肉湯分裝試管，每管約5 mL，塞上棉塞，用包裝紙扎好待滅菌。

（5）將培養(yǎng)基置高壓蒸汽鍋內(nèi)，121℃滅菌15~30 min。

1.3.2 普通瓊脂培養(yǎng)基的制作

（1）將稱好的瓊脂加到普通肉湯內(nèi)，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將pH調(diào)至7.4~7.6，再加熱煮沸20 min。

（2）用蒸餾水濕潤夾有薄層脫脂棉的紗布過濾，邊過濾邊分裝試管，每管約4~5 mL（約3指高），試管分裝完畢塞好棉塞，待滅菌。

（3）將培養(yǎng)基置高壓蒸汽鍋內(nèi)，121℃滅菌15~30 min，趁熱將試管口一端擱在玻璃棒上，使之有一定坡度，凝固后即成為普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成為高層瓊脂。

（4）剩余部分的瓊脂用手指感觸，若將瓊脂瓶緊握手中覺得燙手、但仍能持握時，即為傾倒平皿合適溫度（50~60℃）。每只滅菌培養(yǎng)皿倒入10~15 mL，將培養(yǎng)皿蓋蓋上，并將培養(yǎng)皿于桌面輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于培養(yǎng)皿底，即成普通瓊脂平板。

（5）培養(yǎng)基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應(yīng)過濾除菌，再按規(guī)定的量加入到培養(yǎng)基中。

1.3.3 鮮血瓊脂培養(yǎng)基的制作

（1）將滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至50℃左右，加入無菌的家兔鮮血5%（即每100 mL普通瓊脂加鮮血5~6 mL）混合后，分裝滅菌試管立即擺成斜面或傾注于滅菌平皿。待凝固后，置37℃培養(yǎng)24 h，無菌檢驗合格方可應(yīng)用。

（2）無菌血液是用無菌操作方法采自健康動物。將家兔血液加到盛有5%滅菌枸櫞酸鈉的100 mL三角瓶內(nèi)，馬上封住瓶口快速而柔和地?fù)u晃直到看見上層出現(xiàn)白色纖維蛋白，除掉纖維蛋白后置7℃冰箱中待用。

1.4 病料采集

2016年7—9月，分別采集天津市武清區(qū)某生豬養(yǎng)殖場患病豬只病料，其中傷口分泌物22份、膿汁8份、糞便5份、滲出液7份，共42份。把取得的42份病料分別置于無菌生理鹽水中，充分混勻，制成稀釋液，保存在5℃冰箱中待用。

1.5 分離培養(yǎng)

1.5.1 增菌培養(yǎng) 將采集后配制的稀釋液2 mL接

入7.5%NaCl肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.5.2 劃線分離培養(yǎng)

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開呈20°左右的角度。

（2）右手持接種環(huán)，從采集的細(xì)菌肉湯中取少許涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燃燒，待接種環(huán)冷卻后，再與所涂的地方輕輕接觸，開始劃線。

日糧蛋白質(zhì)水平和RPFA對干物質(zhì)采食量、日增重和料重比不存在交互作用（見表2）。肉牛干物質(zhì)采食量和初始體重各組間無顯著差異（P＞0.05）。試驗?zāi)w重隨日糧蛋白質(zhì)水平增加無顯著差異（P＞0.05），但隨RPFA的添加而增加（P＜0.05）。平均日增重隨日糧蛋白水平的提高和RPFA的添加而增加（P＜0.05）。肉牛料重比隨日糧蛋白水平的提高和RPFA的添加而降低（P＜0.05）。

（3）劃線前先將接種環(huán)稍稍彎曲，這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基。

（4）劃線中不宜過多的重復(fù)舊線，以免形成菌苔。

（5）接種完畢，在平皿底部作好菌名、日期和接種者等標(biāo)記，平皿倒扣，置于37℃培養(yǎng)24~48 h。

1.6 觸酶試驗

取營養(yǎng)瓊脂上的菌落置于潔凈試管內(nèi)或潔凈玻片上，滴加3%H2O2溶液數(shù)滴，觀察結(jié)果，如1 min內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生為陽性，不產(chǎn)生或氣泡量少為陰性。

1.7 生化試驗

1.7.1 菌液制備 取培養(yǎng)基上新鮮菌落制成麥?zhǔn)媳葷峁?號及0.5號菌液各1管約1.5 mL，另取已制備好的3號菌液4滴，加入2滴甲苯用于β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）。1.7.2 試驗操作

（1）堿磷酶、尿素酶、吡咯烷酮芳胺酶（PYR試驗）及木糖試驗均加相當(dāng)于3號麥?zhǔn)媳葷峁軡舛染焊?滴。

（2）ONPG加相當(dāng)于3號麥?zhǔn)媳葷峁軡舛染?滴及2滴甲苯。

（3）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗葡萄糖管用液體石蠟加封。

1.7.4 判定方法

（1）堿磷酶試驗管內(nèi)加兩滴1 mol/L NaOH，5 min變?yōu)辄S色為陽性，否則為陰性。（2）ONPG試驗變成黃色為陽性，否則為陰性。（3）尿素酶試驗變?yōu)榧t色為陽性，否則為陰性。（4）PYR試驗管內(nèi)加入一滴PYR顯色劑5 min呈現(xiàn)紅色為陽性，否則為陰性。

（5）木糖試驗變成黃色為陽性，否則為陰性。

（6）無氧條件下發(fā)酵葡萄糖為葡萄糖球菌（發(fā)酵型），不發(fā)酵為微球菌（氧化型）。

1.8 藥敏試驗

1.8.1 材料準(zhǔn)備 菌種：金黃色葡萄球菌。藥敏試紙：先鋒V、青霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素的藥敏紙片。器材：酒精燈、小鑷子、普通瓊脂平板。1.8.2 操作方法 取金黃色葡萄球菌種，用滅菌接種環(huán)致密劃線于瓊脂平板表面（可重復(fù)來回劃線），或用“十”字劃線法。用無菌鑷子將各種抗菌藥物圓片分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等。在皿底標(biāo)記記號1~30，37℃培養(yǎng)24 h觀察[3]。

2 試驗結(jié)果

2.1 分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征

平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，邊緣整齊、表面光滑、濕潤，直徑一般為1～2 mm。

2.2 分離菌在血平板上的菌落特征

平板上菌落呈金黃色，有時也呈白色，大而凸起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的β溶血環(huán)。

2.3 分離菌染色觀察

菌株革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列，無芽孢、莢膜。

2.4 觸酶試驗結(jié)果

玻片上滴加雙氧水后產(chǎn)生大量氣泡，表明分離菌為觸酶陽性。

2.5 生化試驗結(jié)果

分離菌在堿磷酶試驗中呈陽性，在ONPG試驗中呈陰性，在尿素酶試驗中呈陽性，在PYR試驗中呈陰性，在木糖試驗中呈陰性，在O/F葡萄糖試驗中呈陽性（表 1）[4]。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果

由以上試驗結(jié)果可知分離菌為金黃色葡萄球菌。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

由表2可知，金黃色葡萄球菌對先鋒V敏感性最高達(dá)93.3%；其次是慶大霉素和氯霉素，敏感率分別為73.3%、66.7%；而對四環(huán)素、青霉素、鏈霉素、紅霉素敏感率相對較低，分別為40%、30%、20%、6.7%。金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、紅霉素具有一定的耐藥性，其耐藥率分別為33.3%、36.7%、60%。

表2 30株金黃色葡萄球菌對抗生素藥敏試驗結(jié)果 株

3 討論

葡萄球菌在自然界中分布廣泛，絕大多數(shù)不致病，僅少數(shù)引起人和動物的化膿性感染。其致病性隨細(xì)菌侵入途徑、菌量、毒力及機(jī)體免疫力不同而不同。由于抗生素的廣泛使用，耐藥菌株逐年增加，目前葡萄球菌屬中引起致病性的金黃色葡萄菌對青霉素的耐藥率已高達(dá)90%[6]，給臨床治療造成了很大的困難。

通過本試驗采集的病料來看，豬只感染發(fā)病一部分來自于葡萄球菌感染，而主要致病菌為金黃色葡萄球菌。同時，本試驗對從42份病料中獲得的30株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗結(jié)果現(xiàn)示，金黃色葡萄球菌對先鋒V、慶大霉素、氯霉素有較高的敏感性，雖然其對青霉素、鏈霉素、紅霉素也有較低的高敏感性，但耐藥性更高。

4 結(jié)論

本試驗對從42份病料中獲得的30株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌對先鋒V的敏感性最高，高達(dá)93.3%；其次是慶大霉素和氯霉素，敏感率分別為73.3%、66.7%；而對四環(huán)素、青霉素、鏈霉素、紅霉素敏感率相對較低，分別為40%、30%、20%、6.7%。金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、紅霉素具有一定的耐藥性，其耐藥率分別為33.3%、36.7%、60%。因此，患病豬只被金黃色葡萄球菌感染后，建議采用先鋒V、慶大霉素抗生素進(jìn)行治療。同時，建議對常用抗生素治療效果欠佳的皮膚、傷口等感染應(yīng)做細(xì)菌培養(yǎng)和藥物敏感試驗，以選取敏感藥物，避免抗生素的濫用，減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。但要注意到是藥物的用量和使用時間，不宜長期固定使用一種藥物，應(yīng)該經(jīng)常更換藥物品種或適時停用。

最后要定期進(jìn)行疫病檢查，定期及時消毒豬舍和飼養(yǎng)場，這對隱性感染和帶菌排菌的豬來說十分重要。同時做好患病豬的處理工作，對一般性傳染病，應(yīng)及時隔離，積極治療；對不宜治愈的豬只最好采取撲殺辦法，尸體深埋或焚燒，以徹底消滅傳染源。

[1] 王江橋，羅君，蔡珠，等.金黃色葡萄球菌感染的特征及其耐藥性[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14（4）：990-991.

[2] 朱以軍，徐瑞龍，單小云，等.醫(yī)院感染葡萄球菌屬的分布特點(diǎn)與耐藥性[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（5）：599-601.

[3] 王悅，楊敬芳，張魯濤，等.318株金黃色葡萄球菌的臨床科室分布、耐藥性及其感染的預(yù)防[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，29（6）：869-837.

[4] 陳林珍，李曉穗，李瑞瑩.351株葡萄球菌的鑒定及藥敏試驗[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2005（5）：330-332.

[5] 李素梅.131株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥性分析[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，25（4）：439-440.

[6] 方玲，陳江華，顧向明，等.臨床常見病原菌分布及耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（4）：210-211.

老用消毒劑肺病風(fēng)險高

一項最新研究發(fā)現(xiàn)，使用消毒劑會增大罹患肺病的風(fēng)險。慢阻肺通常與吸煙相關(guān)，但經(jīng)常吸入漂白劑或消毒液中所含強(qiáng)刺激性化合物也會導(dǎo)致患病風(fēng)險增加。研究稱，頻繁使用漂白劑、消毒液，可使慢阻肺風(fēng)險提升32%。

該研究由法國國家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究所組織開展。研究人員以5.5萬名女護(hù)士為研究對象，了解她們接觸各種消毒劑的數(shù)量并研究這種接觸與慢阻肺之間的關(guān)聯(lián)。研究始于2009年，當(dāng)時參與的護(hù)士都在崗，且都沒得過慢阻肺。8年后，其中663名護(hù)士被確診患上慢阻肺。研究人員評估分析了這些護(hù)士接觸漂白劑、消毒液的情況，并剔除了吸煙、年齡、體質(zhì)和種族等可能影響研究結(jié)果的諸多因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院中消毒、清潔常用的漂白劑、雙氧水、酒精、季銨化合物等都與慢阻肺有關(guān)聯(lián)，罹患風(fēng)險增加24%~32%不等。

法國國家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究所奧麗安娜·杜馬斯說：“雖然近期有研究顯示清潔工患慢阻肺的風(fēng)險較高，但接觸消毒劑的潛在負(fù)面影響未受到足夠重視。我們還需研究特定職業(yè)終生接觸消毒劑和罹患慢阻肺的關(guān)聯(lián)，并搞清楚任一特定消毒劑的具體危害。”

（摘自《生命時報》2017.09.22李 偉/文）

S858.282.61

A

1002-1957(2017)06-0108-03

2017-08-28收稿，2017-09-20修回

龔 岳（1989-），男，天津武清人，助理獸醫(yī)師，主要從事動物產(chǎn)地檢疫、疫病防控和畜禽安全質(zhì)量檢測等工作.

E-mail:760156091@qq.com

（編輯：富春妮）