2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測數據統計分析與預防對策

牟 迪，夏 偉

（哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬病防制與保健

2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測數據統計分析與預防對策

牟 迪，夏 偉

（哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

腹瀉是養豬生產中常見的疾病之一，可引起哺乳仔豬大量死亡，給全球養豬業造成重大的經濟損失。豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是臨床上導致豬腹瀉的重要病毒之一。臨床上的發病癥狀主要表現為腹瀉、嘔吐和脫水，該病不分年齡、性別和品種均可感染，哺乳仔豬的發病率和死亡率最高，肥育豬癥狀較輕，但也可致死。

哈獸維科技術服務部檢測實驗室于2015年1月至2017年9月期間共收到全國24個省市217個規模豬場的748份病料（糞便及腸道內容物）。通過PCR方法對流行性腹瀉病毒病原進行檢測，2015年1—12月PEDV陽性檢出率為56.38%（84/149），2016年1—12月陽性檢出率為40.98%（125/305），2017年1—9月陽性檢出率為41.50%（122/294）。并采用PCR和RT-PCR方法檢測采集豬場中PEDV與其他6種病毒類疾病病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒 2型（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）的混合感染情況。2015年1月至2017年9月PEDV單一檢出率為 73.72%，PEDV與 PRRSV混合感染檢出率6.95%，PEDV與PCV2混合感染檢出率 5.74%，PEDV與PoRV混合感染檢出率2.42%。3種病原混合感染中，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率3.02%，PEDV與 PRRSV、PCV2混合感染檢出率1.81%。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分布

樣品來源于全國24個省市217個豬場，樣品包括腸道內容物和糞便以及肺臟、脾臟和淋巴結等組織，通過調查了解豬場免疫背景和臨床發病情況以及剖檢典型發病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢。

1.2 主要試劑和儀器

PCR和RT-PCR擴增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、TRIZOL（總 RNA 抽提試劑，主要成分苯酚等）、DL 2 000 Marker、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0均購自寶生物工程（大連）有限公司。生物安全柜、分析天平、高速離心機、迷你掌上離心機、渦旋振蕩器、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.3 引物設計與合成

根 據 GenBank 登 陸 的 PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2的基因序列，用 Oligo 6.0軟件設計引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 用于PCR和RT-PCR反應的引物

1.4 樣品處理及核酸提取

按檢測需求分別對腸內容物和糞便混合，肺臟、脾臟、淋巴結樣品混合用研磨器充分研磨，利用MEM營養液進行10倍稀釋，然后利用DNA和RNA提取試劑盒進行核酸抽提。

1.5 病毒核酸檢測

用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應條件94 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個循環，72℃延伸10 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 病毒核酸檢測

1.6.1PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV 的擴增分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒（博日公司）從病毒培養液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒進行RT-PCR擴增，反應條件 RT：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；PCR：（94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35個循環，72 ℃延伸7 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6.2 PRV、PCV2的擴增 分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應條件94℃2 min；（94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）×35個循環，72 ℃延伸10 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 PEDV病原PCR擴增結果

2.1.1 2015年1—12月收到全國48個規模豬場的149份（糞便與腸道內容物）樣品，流行性腹瀉病毒（PEDV）陽性率 56.38%（84/149），2016年 1—12月收到全國94個規模豬場的305份樣品，流行性腹瀉病毒陽性率為40.98%（125/305）。2017年1—9月收到75個規模豬場的294份樣品，陽性率為41.50%（122/294），具體月份病原檢出率及豬場陽性率見表2、表 3。

表2 2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原檢測陽性率統計

表3 2015—2017年豬流行性腹瀉病毒病原陽性豬場統計

2.1.2 2015 年送檢樣品中 PEDV 在第 2、6、7、12月份檢出率較高，分別為100.00%、71.43%、75.00%、74.47%。2016年 PEDV 在第 2、3、10、12月份檢出率分別為83.33%、60.87%、61.11%、61.90%，相對較高。而在2017年1—9月中相對檢出率較高的是2、4月份，檢出率分別為87.10%和72.00%。各月份豬流行性腹瀉檢出率動態變化見圖1、圖2、圖3。

圖1 2015年豬流行性腹瀉病毒檢出率動態變化

圖2 2016年豬流行性腹瀉病毒檢出率動態變化

圖3 2017年1—9月豬流行性腹瀉病毒檢出率動態變化

2.2 PEDV混合感染結果

2.2.1 統計2015年1月至2017年9月檢測PEDV陽性病料與其他病原混合感染情況，共127個PEDV陽性豬場中，PEDV與PCV2混合感染豬場14個，PEDV與PRRSV混合感染豬場9個，PEDV與PoRV混合感染的豬場6個，在兩種病原混合感染的豬場中數量最多。PEDV與PCV2和PRV的混合感染豬場有6個，是3種病原混合感染豬場數量最多的，見表4。

2.2.2 2015年檢測出PEDV陽性樣品84份（表5），其中PEDV單一感染檢出率73.81%，PEDV與PCV2混合感染檢出率5.95%，PEDV與TGEV、PoRV混合感染檢出率5.95%（圖4）。2016年檢出PEDV陽性樣品125份，PEDV單一感染檢出率60.80%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率12.00%，PEDV與PCV2混合感染檢出率7.20%，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率5.60%（圖5）。2017年1—9月檢出PEDV陽性樣品122份，PEDV單一感染檢出率86.89%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率4.92%，PEDV與PCV2混合感染檢出率4.09%（圖6）。

表4 各種混合感染形式檢出豬場數統計 個

表5 各種混合感染形式檢出樣品數統計 份

圖4 2015年PEDV與其他病毒混合感染情況

圖5 2016年PEDV與其他病毒混合感染情況

圖6 2017年1—9月PEDV與其他病毒混合感染情況

2.2.3 2015年1月至2017年9月，共檢測出PEDV陽性樣品331份，其中，PEDV單一檢出率為73.72%，PEDV與PRRSV混合感染檢出率6.95%，PEDV與PCV2混合感染檢出率5.74%，PEDV與PoRV混合感染檢出率2.42%。3種病原混合感染中，PEDV與PCV2、PRV混合感染檢出率3.02%，PEDV與PRRSV、PCV2混合感染檢出率1.81%。見圖7。

圖7 2015年1月至2017年9月PEDV與其他病毒混合感染情況

3 討論

（1）2015年1月至2017年9月通過對全國24個省市217個規模豬場的748份糞便及腸道內容物檢測PEDV病原，臨床上表現為新生仔豬發病率和死亡率高，水樣腹瀉，剖檢內容物稀薄，腸壁菲薄為主。選用合適的引物，采用PCR方法對PEDV病毒病原檢測和數據統計分析得知，2015年PEDV陽性檢出率56.38%（84/149），2016年PEDV病原陽性檢出率下降為 40.98%（125/305），2017年 1—9月 PEDV病原陽性檢出率又有所上升，為41.50%（122/294）。

（2）從各個月份的PEDV陽性檢出率來看，2015 年第2、6、7、12月份檢出率較高。2016年第 2、3、10、12月份檢出率相對較高。而在2017年1—9月中相對檢出率較高的是2、4月份。可以看出，2月、12月，天氣寒冷，晝夜溫差大，PEDV檢出率相對較高，但其他月份檢出率沒有形成季節性的規律，夏季檢出率也較高，可見PEDV的流行已經沒有明顯的季節性。

（3）從PEDV病原混合感染情況可看出，PEDV單一感染現象最為嚴重，另外PEDV與PRRSV、PEDV與PCV2、PEDV與PoRV在兩種病原混合感染中最為常見，PEDV與PCV2、PRV 3種病原的混合感染也占有一定的比例。建議豬場做好PEDV防疫的同時，也要做好PCV2、PRRSV、PRV等3個病原的防疫工作，感染陽性場豬場引種要慎重。

（4）由于豬流行性腹瀉等病毒病發生腹瀉，大多數發病日齡小，發病急，病死率高，基本無特效的治療藥物。因此采取接種疫苗結合科學的管理等綜合措施是控制豬病毒性腹瀉的有效手段。推薦免疫程序：種公豬/母豬8月份每年普免1次，1頭份/頭，間隔3周加強免疫，過30 d對產前40～50 d妊娠母豬免疫1頭份/頭，產前20～30 d加強免疫1頭份/頭（建議常年跟胎次免疫），豬病毒性腹瀉三聯活疫苗，產前10～15 d免疫PED滅活疫苗4 mL/頭，仔豬斷奶時免疫1頭份/頭，后備豬配種前免疫2次，間隔21d，1頭份/次。

S858.285.3

A

1002-1957(2017)06-0089-04

2017-10-31

牟 迪（1988-），男，黑龍江哈爾濱人，碩士，主要從事動物疫苗技術服務工作.E-mail：281032446@qq.com

（編輯：郭玉翠）