非小細胞肺癌組織miR-564表達變化及其與患者臨床病理參數和預后的關系

楊穎諭，張李紅，羅賢勇，張建坤，李生強，龐國蓮，錢玉蓮

(曲靖市第一人民醫院，云南曲靖655000)

非小細胞肺癌組織miR-564表達變化及其與患者臨床病理參數和預后的關系

楊穎諭，張李紅，羅賢勇，張建坤，李生強，龐國蓮，錢玉蓮

(曲靖市第一人民醫院，云南曲靖655000)

目的探討微小RNA-564(miR-564)在非小細胞肺癌(NSCLC)發生、發展中的作用。方法選擇NSCLC患者43例，取手術切除的癌組織及其癌旁正常組織，采用qRT-PCR法檢測兩種組織中miR-564表達，并分析miR-564表達與患者臨床病理參數和預后的關系。結果NSCLC組織miR-564相對表達量為12.43±3.17，癌旁正常組織為21.76±4.49，二者比較P<0.01。以NSCLC組織miR-564相對表達量的平均值為截斷值，將患者分為miR-564低表達者21例、miR-564高表達者22例。miR-564表達與患者TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與性別、年齡、吸煙、組織類型、組織分化程度無關(P均>0.05)。miR-564高表達者總生存期為(40±28)個月、無病生存期為(42±25)個月，miR-564低表達者分別為(38±25)、(40±23)個月；二者比較P均<0.05。結論NSCLC組織miR-564表達下調，其表達變化與腫瘤進展和患者預后有關。

非小細胞肺癌；微小RNA-564；細胞增殖

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的組織學類型，占肺癌總數的80%～85%[1]。盡管各種新興技術不斷用于治療NSCLC，但患者5年生存率仍然不超過15%[2]。劉月姣等[3]研究認為，腫瘤侵襲和轉移與NSCLC患者預后差密切相關。因此，探尋敏感特異的腫瘤分子生物學標志物對NSCLC早期診斷和預后評估意義重大。微小RNA(miRNA)是一類長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于多種生物體內。既往研究證實，某些miRNA在人類惡性腫瘤組織中異常表達，并通過調控一系列基因表達發揮癌基因或抑癌基因作用。miR-564是近年新發現的一種miRNA，有研究發現，在胃癌細胞中miR-564通過與其靶基因結合，發揮類似抑癌基因作用[4]。但目前關于miR-564表達與NSCLC的關系鮮見報道。本研究觀察了NSCLC組織miR-564表達變化，并分析其與患者臨床病理參數及預后的關系。現分析結果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年6月～2012年8月曲靖市第一人民醫院收治的初診NSCLC患者43例。所有患者符合美國癌癥聯合委員會和國際抗癌聯盟2010年制定的NSCLC診斷與分期標準[5]，并經術后病理檢查明確診斷。排除術前接受放療、化療或其他抗癌治療者，合并間質性肺炎等其他肺部疾病者，妊娠期或哺乳期患者。其中，男28例、女15例，年齡(57±13)歲，有吸煙史25例；組織類型：鱗癌19例、腺癌24例，TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期22例；組織分化程度：低、中分化25例，高分化18例；有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移27例。本研究經曲靖市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 miR-564表達檢測 采用qRT-PCR法。取手術切除的NSCLC組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>3 cm，并經病理檢查確認)，采用TRIzol法提取各組織總RNA，采用Nanodrop2000超微量分光光度計鑒定總RNA的濃度和純度合格。根據miR-564的反轉錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCA-TT-3′進行反轉錄，取反轉錄產物進行PCR擴增。所有引物由上海英駿生物技術有限公司設計合成。引物序列：miR-564上游引物：5′-AAGGGGGCTATGGAAAGGCAA-3′，下游引物： 5′-AATCCACGATGAA-GGGATGCT-3′；內參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATT-TGC-3′。PCR反應體系共20 μL：5×loading buffer 5 μL、MgCl21 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL、Tag酶0.125 μL，滅菌水補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s、60 ℃延伸40 s，共35個循環，最后74 ℃延伸5 min。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-564相對表達量。實驗重復3次，取平均值。比較NSCLC組織及癌旁正常組織miR-564相對表達量。以NSCLC組織miR-564相對表達量的平均值為截斷值，將NSCLC患者分為miR-564低表達者和高表達者，分析NSCLC組織miR-564表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 隨訪方法 通過電話、信件或門診等方式進行隨訪，隨訪截至2017年2月18日，失訪12例。統計NSCLC患者總生存期(OS)、無病生存期(DFS)。DFS是指從隨機化臨床試驗開始至疾病復發或因任何原因導致死亡的時間。OS是指從隨機化臨床試驗開始至任何原因引起患者死亡的時間。

2 結果

2.1 NSCLC組織及癌旁正常組織miR-564表達比較 NSCLC組織miR-564相對表達量為12.43±3.17，癌旁正常組織為21.76±4.49；二者比較P<0.01。

2.2 NSCLC組織miR-564表達與患者臨床病理參數的關系 miR-564低表達者21例，高表達者22例。NSCLC組織miR-564表達與患者臨床病理參數的關系見表1。

2.3 NSCLC組織miR-564表達與患者預后的關系 NSCLC患者miR-564高表達者OS為(40±28)個月、DFS為(42±25)個月，miR-564低表達者分別為(38±25)、(40±23)個月；二者比較P均<0.05。見圖1。

3 討論

研究發現，miRNA主要通過與其靶基因mRNA的3′-UTR端互補結合降解mRNA或抑制mRNA翻譯，從而阻遏基因表達，參與機體的多種生物學行為，如早期發育、細胞增殖、細胞凋亡等[6,7]。miRNA表達異常與惡性腫瘤關系密切，如miR-16在肺癌細胞中表達下調，通過將細胞阻滯于G0/G1期而發揮類似抑癌基因作用[8]；miR-21在NSCLC細胞中表達上調，并能促進腫瘤細胞侵襲和遷移，具有癌基因作用[9]。與其他類型腫瘤生物學標志物比較，miRNA具有穩定性好、敏感性和特異性均較高等優點，故其在腫瘤的早期診斷、病情預測、預后評估等方面具有潛在的臨床應用價值。

表1 NSCLC組織miR-564表達與患者臨床病理參數的關系

注：A為NSCLC組織不同miR-564表達者OS比較；B為NSCLC組織不同miR-564表達者DFS比較。

圖1NSCLC組織miR-564表達與患者預后的關系

miR-564是近年新發現的一種miRNA，正常情況下主要表達于內皮細胞。近年研究發現，miR-564在惡性腫瘤的發生、進展中扮演重要角色。現已證實，miR-564在乳腺癌、胃癌、結腸癌等組織中表達下調，并與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關[10～13]，具有類似抑癌基因的作用。推測miR-564有可能成為某些惡性腫瘤早期診斷和預后評估的分子生物學標志。目前關于miR-564的作用機制尚不完全清楚。Jiang等[14]研究發現，miR-564能抑制表皮生長因子受體(EGFR)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)表達，繼而抑制膠質母細胞瘤細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制可能與阻斷TGF-β1信號通路有關。Rokah等[15]研究發現，慢性髓系白血病患者外周血miR-564低表達，其表達變化與病情進展密切相關；雷帕霉素靶蛋白、血管內皮生長因子、EGFR等可能均參與了miR-564介導的生物學過程。

本研究結果顯示，NSCLC組織miR-564相對表達量明顯低于癌旁正常組織，提示在NSCLC中miR-564可能具有抑癌基因作用。Mutlu等[11]研究發現，乳腺癌組織miR-564表達明顯低于正常乳腺組織，并與血管浸潤、臨床分期、淋巴結轉移、生存期和復發時間密切相關。本研究結果顯示，miR-564低表達與NSCLC患者TNM分期、淋巴結轉移有關，miR-564表達越低，TNM分期越高，淋巴結轉移風險越大，與Chacolla-Huaringa等[16]研究結論基本一致。朱鵬沖等[17]研究認為，組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移是預測NSCLC患者預后的獨立因素，推測miR-564亦可能與NSCLC患者預后有關。為證實上述推測，本研究對NSCLC患者進行遠期隨訪，結果發現NSCLC患者miR-564高表達者OS、DFS均較miR-564低表達者明顯延長，說明miR-564表達變化與NSCLC患者預后有關。

綜上所述，NSCLC組織miR-564表達下調，其表達變化與腫瘤進展和患者預后有關；miR-564有可能成為NSCLC早期診斷和預后評估的分子生物學標志之一。

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張建坤(E-mail： zhangjianknu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.025

R734.2

B

1002-266X(2017)44-0078-03

2017-08-08)