納米銀對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

孔立茶，劉少云，楊雪佳，崔慎情，孔繼昌

(華北石油管理局總醫(yī)院，河北任丘062552)

納米銀對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

孔立茶，劉少云，楊雪佳，崔慎情，孔繼昌

(華北石油管理局總醫(yī)院，河北任丘062552)

目的探討納米銀對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)凋亡的影響及其可能的機(jī)制。方法取生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的HCAEC，分別加入濃度為0、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的納米銀溶液，作用24 h。采用MTT法檢測HCAEC凋亡率，ELISA法檢測培養(yǎng)液上清血紅素氧合酶1(HO-1)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(PECAM-1)表達(dá)，火焰原子吸收光譜法檢測細(xì)胞內(nèi)、外銀含量。結(jié)果加入2.5、5、10、20、40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC凋亡率分別為8.51%、21.03%、42.38%、64.62%、78.35%、74.83%。隨著加入納米銀溶液濃度升高，HCAEC培養(yǎng)液上清HO-1表達(dá)逐漸升高，各濃度間比較P均<0.05；加入40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC培養(yǎng)液上清HO-1表達(dá)比較P>0.05。HCAEC加入10、20、40、80 μg/mL納米銀溶液后細(xì)胞培養(yǎng)液上清PECAM-1表達(dá)均高于0、2.5、5 μg/mL納米銀溶液，且加入40、80 μg/mL納米銀溶液后PECAM-1表達(dá)升高更明顯(P均<0.05)。加入2.5、5、10、20 μg/mL納米銀溶液的HCAEC細(xì)胞內(nèi)銀含量低于細(xì)胞外(P均<0.01)，加入40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC細(xì)胞內(nèi)、外銀含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論納米銀可促進(jìn)HCAEC凋亡，其細(xì)胞毒性作用呈濃度依賴性；通過上調(diào)HO-1、PECAM-1表達(dá)造成細(xì)胞損傷可能是其作用機(jī)制。

納米銀；人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；血紅素氧合酶1；血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1

納米銀具有廣譜抗菌性，目前多種納米銀材料被應(yīng)用于眾多醫(yī)療設(shè)備和產(chǎn)品中[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀通過皮膚或血液接觸進(jìn)入人體內(nèi)，經(jīng)由血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)循環(huán)分布到肺、肝臟、腎臟和大腦等器官，并開始逐漸積累[3]，不僅能夠造成細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞活力下降、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，還能引起細(xì)胞DNA 損傷、染色體畸變和細(xì)胞周期抑制等[4～6]；此外還可引發(fā)心血管效應(yīng)，甚至促發(fā)動脈粥樣硬化[7]。動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能受損在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但目前關(guān)于納米銀對動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的報道較少。2016年7月～2017年1月，本研究觀察了納米銀對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)的細(xì)胞毒性作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：HCAEC購自中科院上海細(xì)胞庫。主要試劑：納米銀溶液(粒徑1～30 nm)購自韓國Nanux公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；FBS、雙抗和0.25%胰酶消化液購自美國Gibco公司；MTT、DMSO購自美國Sigma公司；血紅素氧合酶1(HO-1)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(PECAM-1)ELISA試劑盒購自美國BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自德國Eppendorf公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將HCAEC置于含10% FBS、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的HCAEC，分別加入0(即不加入納米銀溶液)、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的納米銀溶液，作用24 h。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測 采用MTT法。細(xì)胞處理24 h，棄去培養(yǎng)液，重新加入180 μL培養(yǎng)液及20 μL MTT，輕輕混合后，常規(guī)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使甲臜充分溶解。使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(OD)值，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=[(OD對照-OD空白)-(OD實驗-OD空白)]/(OD對照-OD空白)×100%。

1.4 培養(yǎng)液上清HO-1、PECAM-1表達(dá)檢測 采用ELISA法。細(xì)胞處理24 h，吸取培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測HO-1、PECAM-1表達(dá)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞內(nèi)、外銀含量檢測 采用火焰原子吸收光譜法。細(xì)胞處理24 h，吸取培養(yǎng)液上清，保存于離心管中。將剩余細(xì)胞及培養(yǎng)液使用PBS緩沖液清洗4～5次，將清洗后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，加入低滲液，將細(xì)胞吹打均勻，置于冰水中，用超聲破碎儀將細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎。采用火焰原子吸收分光光度計檢測超聲破碎后細(xì)胞懸液及培養(yǎng)液上清中的銀含量，即為細(xì)胞內(nèi)、外銀含量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡率 加入2.5、5、10、20、40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC凋亡率分別為8.51%、21.03%、42.38%、64.62%、78.35%、74.83%。

2.2 培養(yǎng)液上清HO-1、PECAM-1表達(dá) 隨著加入納米銀溶液濃度的升高，HCAEC培養(yǎng)液上清HO-1表達(dá)逐漸升高，各濃度間比較P均<0.05；加入40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC培養(yǎng)液上清HO-1表達(dá)比較P>0.05。加入10、20、40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC培養(yǎng)液上清PECAM-1表達(dá)均高于加入0、2.5、5 μg/mL納米銀溶液的HCAEC，且加入40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC培養(yǎng)液上清PECAM-1表達(dá)升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 加入不同濃度納米銀溶液的HCAEC培養(yǎng)液上清HO-1、PECAM-1表達(dá)比較

注：與0 μg/mL比較，*P<0.05；與2.5 μg/mL比較，#P<0.05；與5 μg/mL比較，△P<0.05；與10 μg/mL比較，▽P<0.05；與20 μg/mL比較，▲P<0.05。

2.3 細(xì)胞內(nèi)、外銀含量 隨著加入納米銀溶液濃度的升高，HCAEC細(xì)胞內(nèi)外銀含量均逐漸升高。加入2.5、5、10、20 μg/mL納米銀溶液的HCAEC細(xì)胞內(nèi)銀含量低于細(xì)胞外(P均<0.01)，加入40、80 μg/mL納米銀溶液的HCAEC細(xì)胞內(nèi)、外銀含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

3 討論

研究證實，納米銀在不同的哺乳動物細(xì)胞系中均能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)[8～11]；能對中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性及遺傳毒性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。Chairuangkitti等[8]體外研究發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒對人肺腺癌A549細(xì)胞的毒性作用與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。Sambale等[13]研究表明，納米銀能夠影響人肺腺癌A549細(xì)胞形態(tài)，并促進(jìn)其凋亡，但誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用并不是由銀離子直接導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可通過誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致線粒體受損，激發(fā)凋亡因子受體信號，引起一系列Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14,15]；納米銀還能誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)炎癥，甚至促發(fā)動脈粥樣硬化(AS)[7]。AS是一種慢性進(jìn)行性炎性疾病，其發(fā)生的主要病理機(jī)制為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能發(fā)生障礙。本研究結(jié)果顯示，納米銀溶液能促進(jìn)HCAEC細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞毒性作用呈濃度依賴性，與上述研究結(jié)論一致。

表2 加入不同濃度納米銀溶液的HCAEC細(xì)胞內(nèi)、外銀含量比較

注：與0 μg/mL比較，*P<0.05；與2.5 μg/mL比較，#P<0.05；與5 μg/mL比較，△P<0.05；與10 μg/mL比較，▽P<0.05；與20 μg/mL比較，▲P<0.05；與40 μg/mL比較，▼P<0.05。

HO-1是誘導(dǎo)型血紅素氧合酶，一般情況下在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較低，但在應(yīng)激、缺氧或缺血等情況下會誘導(dǎo)其過表達(dá)，其表達(dá)升高具有抑制炎性反應(yīng)、防止血管硬化、抗AS斑塊形成的作用[16～18]。免疫球蛋白超家族的PECAM-1是與AS發(fā)生密切相關(guān)的一類細(xì)胞黏附因子，內(nèi)皮細(xì)胞表面的PECAM-1能夠參與維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性，還能介導(dǎo)炎性因子、參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19,20]。當(dāng)AS發(fā)生時血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，細(xì)胞HO-1、PECAM-1表達(dá)均顯著升高[21]。本研究結(jié)果顯示，隨著納米銀溶液濃度升高，細(xì)胞培養(yǎng)液上清HO-1、PECAM-1表達(dá)均呈升高趨勢；提示納米銀能夠通過上調(diào)HO-1、PECAM-1表達(dá)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，間接參與AS的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，納米銀溶液干預(yù)后HCAEC細(xì)胞內(nèi)銀含量高于細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)銀含量隨著加入納米銀溶液濃度的升高而逐漸升高，當(dāng)加入納米銀溶液的濃度達(dá)到40、80 μg/mL時，HCAEC細(xì)胞內(nèi)、外銀含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；說明當(dāng)納米銀溶液濃度達(dá)到40 μg/mL時，納米銀開始大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并對其造成損害。

綜上所述，納米銀可促進(jìn)HCAEC凋亡，其細(xì)胞毒性作用呈濃度依賴性；通過上調(diào)HO-1、PECAM-1表達(dá)造成細(xì)胞損傷可能是其作用機(jī)制。納米銀可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及誘導(dǎo)HCAEC凋亡而參與AS的發(fā)生，其具體作用機(jī)制還需要深入研究和探討。

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劉少云(E-mail： livshaoyun@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.014

R543.3

A

1002-266X(2017)44-0048-03

2017-03-07)