NF-κB信號通路抑制劑對P物質作用后脊髓星形膠質細胞GFAP、炎性因子表達的影響

習亮，梁偉，張永峰

(第四軍醫大學附屬第一醫院 西京醫院，西安710032)

NF-κB信號通路抑制劑對P物質作用后脊髓星形膠質細胞GFAP、炎性因子表達的影響

習亮，梁偉，張永峰

(第四軍醫大學附屬第一醫院 西京醫院，西安710032)

目的探討NF-κB信號通路抑制劑對P物質(SP)作用后脊髓星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、TNF-α、IL-1β及NO表達的影響。方法將脊髓星形膠質細胞隨機分為對照組、SP組和抑制劑組。SP組用含有SP的細胞培養液培養，抑制劑組用含有SP及NF-κB抑制劑SN50的細胞培養液培養，調整SP終濃度為1×10-7mol/L、SN50終濃度為10 μmol/L；對照組僅加入細胞培養液培養。各組作用24 h，采用Western blotting法檢測細胞核轉錄因子κB p65二聚體(NF-κB p65)表達，免疫熒光法檢測細胞GFAP表達，ELISA法檢測細胞培養液上清TNF-α、IL-1β表達，硝酸還原酶法檢測細胞培養液上清NO表達。結果SP組和抑制劑組NF-κB p65相對表達量、GFAP表達均高于對照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。SP組和抑制劑組培養液上清TNF-α、IL-1β、NO表達均高于對照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。結論SP能夠促進脊髓星形膠質細胞活化并分泌NO、TNF-α、IL-1β，NF-κB信號通路抑制劑SN50能夠降低SP的上述作用。

脊髓星形膠質細胞；P物質；核轉錄因子κB；膠質纖維酸性蛋白；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β

神經膠質細胞是除神經元以外的第二大類神經細胞，脊髓星形膠質細胞是中樞神經系統中病理性疼痛傳遞和產生的參與者[1]。P物質(SP)具有調控脊髓星形膠質細胞功能的作用，慢性疼痛能夠通過SP、炎癥因子等傳遞至脊髓星形膠質細胞，從而影響細胞功能的發揮[2～4]。已有研究表明，SP能夠活化脊髓星形膠質細胞[5]。NF-κB參與多種組織、器官炎癥的發生過程，檢測NF-κB p65二聚體水平可以間接反映NF-κB信號通路的狀態[6]。2016年2月～2017年1月， 本研究觀察了NF-κB信號通路抑制劑對SP作用后脊髓星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及炎性因子分泌的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：參照劉濤等[7]的方法于SPF乳鼠中分離、培養脊髓星形膠質細胞，細胞貼壁后經GFAP免疫熒光鑒定為脊髓星形膠質細胞。主要試劑：FBS購于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、PBS購于美國Sigma公司，NF-κB p65單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自于上海威奧生物科技有限公司，NF-κB抑制劑SN50購于美國AnaSpec公司，NO檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所，TNF-α、IL-1β檢測試劑盒均購于上海弘順生物科技有限公司。

1.2 細胞分組處理 取培養至第3代的脊髓星形膠質細胞隨機分為對照組、SP組和抑制劑組。SP組用含有SP的細胞培養液培養，調整其終濃度為1×10-7mol/L；抑制劑組用含有SP及NF-κB抑制劑SN50的細胞培養液培養，分別調整其終濃度為1×10-7mol/L、10 μmol/L；對照組用不含有SP和NF-κB抑制劑SN50的細胞培養液培養。

1.3 細胞NF-κB p65表達檢測 采用Western blotting法。將脊髓星形膠質細胞以2×106個/孔接種至6孔板中，參照1.2的方法進行分組處理。培養24 h，用PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μL細胞裂解液，冰上裂解10 min。用細胞刮刀收集細胞，超聲粉碎5次，每次5 s；8 000 r/min離心5 min，吸取上清液，-70 ℃保存。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白樣品濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液以1∶1的比例混合后于100 ℃水中煮沸5 min。加入到凝膠電泳(10%分離膠、4%濃縮膠)上樣孔中，每孔加入40 μg蛋白樣品，80 V電壓電泳30 min，120 V電壓至結束。50 V電壓在4 ℃條件下轉膜12 h，5%脫脂奶粉在37 ℃條件下封閉90 min。加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育90 min。采用圖像分析軟件分析目的蛋白及內參蛋白GAPDH條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值計算NF-κB p65相對表達量，實驗重復3次。

1.4 細胞GFAP表達檢測 采用免疫熒光法。取1.2中培養24 h的各組細胞，0.1 mol/L PBS洗滌后，加入含5%乙酸的95%乙醇，-20 ℃固定20 min。0.1 mol/L PBS洗滌，加入Tris-HCL緩沖液37 ℃孵育15 min。加入100倍稀釋的GFAP抗體，37 ℃孵育30 min，加入50倍稀釋的GFAP二抗，37 ℃孵育60 min。0.1 mol/L PBS洗滌，50%甘油封片。以PBS代替GFAP抗體作為陰性對照，于200倍顯微鏡下采用ImageJ軟件計算積分光密度(IOD)值，以此表示GFAP表達量，實驗重復3次。

1.5 細胞培養液上清TNF-α、IL-1β表達檢測 采用ELISA法。取1.2中培養24 h的各組細胞，收集培養液上清，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測培養液上清TNF-α、IL-1β表達，實驗重復3次。

1.6 細胞培養液上清NO表達檢測 采用硝酸還原酶法。取1.2中培養24 h的各組細胞，收集培養液上清，按照試劑盒說明書檢測NO表達，實驗重復3次。

2 結果

2.1 各組NF-κB p65、GFAP表達比較 SP組和抑制劑組NF-κB p65相對表達量、GFAP表達均高于對照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組NF-κB p65、GFAP表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SP組比較，#P<0.05。

2.2 各組培養液上清TNF-α、IL-1β及NO表達比較 SP組和抑制劑組培養液上清TNF-α、IL-1β、NO表達均高于對照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組培養液上清TNF-α、IL-1β及NO表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SP組比較，#P<0.05。

3 討論

星形膠質細胞是中樞神經系統內分布最廣的一種膠質細胞，存在于腦、脊髓等組織中，對神經元具有支持、營養、保護、修復等作用[8～11]。近年來研究表明，星形膠質細胞與中樞神經系統的痛覺傳導有關。SP在中樞神經和周圍神經中廣泛存在，是一種神經遞質，參與中樞疼痛感的傳導，在多種慢性疼痛組織SP均升高。研究表明，一定濃度的SP能夠誘發脊髓星形膠質細胞活化[12]。

NF-κB是一種存在于多種組織細胞中的核轉錄因子，在皮膚、肺、淋巴結、骨骼、胚胎組織中均有廣泛表達[13]。NF-κB具有調控炎癥因子和免疫相關基因表達的作用。正常情況下，NF-κB處于非活化狀態，其在細胞質與NF-κB抑制蛋白結合，當受到病理因素作用后，細胞內NF-κB與NF-κB抑制蛋白解離，并調控相關基因的表達[14]。本研究結果顯示，SP組和抑制劑組NF-κB p65相對表達量均高于對照組，且SP組升高更明顯；說明SN50對SP作用后脊髓星形膠質細胞中的NF-κB信號通路有阻斷作用，可降低細胞NF-κB p65表達。GFAP是星形膠質細胞的重要骨架蛋白，也是星形膠質細胞的特異性標志物，其表達上調標志著星形膠質細胞的活化程度升高[15]。本研究結果顯示，SP組和抑制劑組GFAP表達均高于對照組，且SP組升高更明顯；說明SP能夠促進脊髓星形膠質細胞活化，而SN50可降低SP作用后引起的脊髓星形膠質細胞活化。

脊髓星形膠質細胞能夠分泌炎癥及疼痛因子，主要有NO、TNF-α、IL-1β等。IL-1β、TNF-α具有促進炎癥發生的作用[16]。研究表明，TNF-α具有損傷神經元的作用，脊髓星形膠質細胞能夠分泌TNF-α，促進NF-κB激活，引起細胞產生NO等氧自由基[17]。NO具有壽命短、活性高等特點，可參與免疫系統、血液系統、神經系統等多種病理及生理過程的發生。NO能夠影響神經細胞的興奮性，促進感覺傳導[18,19]，其表達升高能促進炎癥和疼痛的發生[20]。本研究結果顯示，SP組和抑制劑組培養液上清TNF-α、IL-1β、NO表達均高于對照組，且SP組升高更明顯；說明SP能夠促進脊髓星形膠質細胞分泌NO、TNF-α、IL-1β，而SN50具有拮抗SP促進脊髓星形膠質細胞分泌NO、TNF-α、IL-1β的作用。

綜上所述，SP能夠促進脊髓星形膠質細胞活化并分泌NO、TNF-α、IL-1β，NF-κB信號通路抑制劑SN50能夠降低SP的上述作用。本研究為進一步探討NF-κB信號通路在脊髓星形膠質細胞功能中的作用機制奠定了基礎，為減輕中樞神經系統相關疾病導致的疼痛及炎癥反應提供了新的思路。

[1] Garré JM, Yang G, Bukauskas FF, et al. FGF-1 triggers pannexin-1 hemichannel opening in spinal astrocytes of rodents and promotes inflammatory responses in acute spinal cord slices[J]. J Neurosci, 2016,36(17):4785-4801.

[2] Eguchi R, Akao S, Otsuguro K, et al. Different mechanisms of extracellular adenosine accumulation by reduction of the external Ca2+concentration and inhibition of adenosine metabolism in spinal astrocytes[J]. J Pharmacol Sci, 2015,128(1):47-53.

[3] Zhang FF, Morioka N, Kitamura T, et al. Proinflammatory cytokines downregulate connexin 43-gap junctions via the ubiquitin-proteasome system in rat spinal astrocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,464(4):1202-1208.

[4] Song Z, Xiong B, Guan X, et al. Minocycline attenuates bone cancer pain in rats by inhibiting NF-κB in spinal astrocytes[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016,37(6):753-762.

[5] Liu J, Du L. PERK pathway is involved in oxygen-glucose-serum deprivation-induced NF-κB activation via ROS generation in spinal cord astrocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,467(2):197-203.

[6] Ohnou T, Yokai M, Kurihara T, et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type 1 receptor signaling evokes long-lasting nociceptive behaviors through the activation of spinal astrocytes in mice[J]. J Pharmacol Sci, 2016,130(4):194-203.

[7] 劉濤,曹富江,徐云強,等.腺病毒介導白細胞介素-6基因對脊髓星形膠質細胞生物學行為的影響[J].中華實驗外科雜志,2015,32(004):850-853.

[8] Xia X, Ma Y, Yang L, et al. Impact of heat shock protein A 12B overexpression on spinal astrocyte survival against oxygen-glucose-serum deprivation/restoration in primary cultured astrocytes[J]. J Mol Neurosci, 2016,59(4):511-520.

[9] Nam Y, Kim JH, Kim JH, et al. Reversible Induction of pain hypersensitivity following optogenetic stimulation of spinal astrocytes[J]. Cell Rep, 2016,17(11):3049-3061.

[10] Qian B, Li F, Zhao LX, et al. Ligustilide ameliorates inflammatory pain and inhibits TLR4 upregulation in spinal astrocytes following complete freund′s adjuvant peripheral injection[J]. Cell Mol Neurobiol, 2016,36(1):143-149.

[11] Jiang BC, Cao DL, Zhang X, et al. CXCL13 drives spinal astrocyte activation and neuropathic pain via CXCR5[J]. J Clin Invest, 2016,126(2):745-761.

[12] Shi P, Chen EY, Cs-Szabo G, et al. Biglycan inhibits capsaicin-induced substance p release by cultured dorsal root ganglion neurons[J]. Am J Phys Med Rehabil, 2016,95(9):656-662.

[13] 張佳,韓彬,柴文戍.血必凈對內毒素誘導血管內皮細胞TLR4-NF-κB炎癥信號通路表達的影響[J].遼寧醫學院學報,2016,37(5):10-12.

[14] 馬莉,沈燕.NF-κB P65 siRNA對IL-17誘導下MCP-1表達的影響作用[J].中國免疫學雜志,2015,31(10):1333-1336.

[15] 林永忠,孫長凱,吳旻,等.胰島素對糖尿病大鼠認知功能及腦星形膠質細胞GFAP表達的影響[J].大連醫科大學學報,2012,34(4):324-328.

[16] Li ZY, Zhang YP, Zhang J, et al. The possible involvement of JNK activation in the spinal dorsal horn in bortezomib-induced allodynia: the role of TNF-α and IL-1β[J]. J Anesth, 2016,30(1):55-63.

[17] Caiazzo M, Giannelli S, Valente P, et al.Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors [J]. Stem Cell Reports, 2015,4(1):25-36.

[18] 宋亞光,魏子淳,王宇,等.針灸預處理對成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓NO分布和c-fos表達的影響[J].中國老年學雜志,2016,36(13):3101-3104.

[19] Finnerup NB, Attal N, Haroutounian S, et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol, 2015,14(2):162-173.

[20] Diochot S, Alloui A, Rodrigues P, et al. Analgesic effects of mambalgin peptide inhibitors of acid-sensing ion channels in inflammatory and neuropathic pain[J]. Pain, 2016,157(3):552-559.

中國博士后科學基金資助項目(2013M532112)。

梁偉(E-mail： pdu_3466@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.013

R741

A

1002-266X(2017)44-0045-03

2017-03-15)