黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其機制

王永清，韓媛媛，韓德蘭，林燕，楊曉華

(1張家口學院, 河北張家口075000；2河北北方學院附屬第一醫院)

黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其機制

王永清1，韓媛媛2，韓德蘭1，林燕1，楊曉華1

(1張家口學院, 河北張家口075000；2河北北方學院附屬第一醫院)

目的探討黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其可能的機制。方法采用腋下接種Lewis 肺癌細胞懸液的方法制備Lewis肺癌小鼠模型50只，隨機分為模型組、順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組，每組10只。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組均給予順鉑2 mg/kg腹腔注射，黃芪多糖低、中、高劑量組同時分別給予黃芪多糖50、100、200 mg/kg腹腔注射，模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射；1次/周，共3周。各組治療3周斷頸處死，稱取腫瘤質量，計算抑瘤率；采用免疫組化法檢測腫瘤組織內皮生長因子(VEGF)、內皮抑素(Endostatin)及凋亡基因蛋白Fas、P53表達，采用流式細胞術檢測外周血T細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+)。結果模型組、順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤質量分別為(1.51±0.46)、(0.52±0.26)、(0.48±0.12)、(0.40±0.02)、(0.29±0.16)g，模型組>順鉑組、黃芪多糖低劑量組>黃芪多糖中劑量組>黃芪多糖高劑量組(P<0.05或<0.01)。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組抑瘤率分別為49.29%、52.13%、57.32%、65.22%。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤組織VEGF表達均低于模型組，Endostatin表達均高于模型組，且黃芪多糖中、高劑量組變化更明顯(P均<0.05)。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤組織Fas、P53表達均高于模型組(P均<0.05)，順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。黃芪多糖低、中、高劑量組外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+均高于順鉑組及模型組(P均<0.05)，黃芪多糖低、中、高劑量組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈濃度依賴性；抑制VEGF表達、提高Endostatin蛋白表達及免疫功能是其可能的機制。

肺癌；黃芪多糖；順鉑；內皮生長因子；內皮抑素；凋亡基因；小鼠

肺癌是呼吸系統常見惡性疾病，患者預后較差，其發病率及病死率居惡性腫瘤首位[1]。化療是臨床治療肺癌的主要手段，但不良反應大，患者常難以耐受[2]。順鉑是臨床常用化療藥物，可抑制腫瘤細胞DNA的復制過程，有較強的廣譜抗癌作用；但其具有明顯的細胞毒性，在殺滅腫瘤細胞的同時亦殺滅正常細胞[3]。研究表明，黃芪多糖可強進正常細胞的免疫功能、減少化療期間不良反應、改善腫瘤患者的生活質量[4]。2016年5～9月，本研究觀察了黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用，現報告結果并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：C57BL/6J小鼠50只，雄性，SPF級，8周齡，體質量(20±2)g，由張家口學院動物實驗中心提供；自由飲食，飼養濕度36%。細胞：Lewis肺癌細胞株購自美國ATCC公司。主要試劑：順鉑購自云南生物谷燈盞花藥業有限公司，黃芪多糖購自陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，小鼠抗小鼠血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體、內皮抑素(Endostatin)單克隆抗體(一抗)購自英國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器：紫外可見分光光度計購自北京瑞利分析儀器制造公司，BD FACS Calibur流式細胞儀購自美國Becton公司。

1.2 模型建立與分組處理 從液氮中將Lewis肺癌細胞株取出，放入37 ℃水中融化，14 000 r/min離心5 min，棄上清，加入生理鹽水進行稀釋，調整細胞密度為1×107個/mL。50只C57BL/6J小鼠適應性喂養1周，取0.2 mL Lewis肺癌細胞懸液接種于C57BL/6J小鼠的右腋皮下，待小鼠腫瘤生長至直徑約為5 mm時隨機分為模型組、順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組，各10只。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組均給予順鉑2 mg/kg腹腔注射，黃芪多糖低、中、高劑量組同時分別給予黃芪多糖50、100、200 mg/kg腹腔注射，模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射；1次/周，共3周。

1.3 腫瘤質量及抑瘤率檢測 各組治療3周斷頸處死，剝離瘤體，稱取腫瘤質量，并計算抑瘤率。抑瘤率=(1-治療組平均腫瘤質量/模型組平均腫瘤質量)×100%。

1.4 腫瘤組織VEGF、Endostatin表達檢測 采用免疫組化法。取部分各組剝離的腫瘤組織，常規石蠟包埋，3 μm厚度切片。將組織切片脫蠟、水化，3% H2O2去離子水孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min。分別滴加小鼠抗小鼠Endostatin單克隆抗體及小鼠抗小鼠VEGF單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3次，每次2 min。滴加聚合物輔助劑(Polymer Helper)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次2 min。滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗、DAB顯色。顯微鏡下觀察VEGF、Endostatin表達并拍照，將所得圖像輸入Image-pro plus6.0軟件，目標區選定后計算積分光密度(IOD)值，以此表示腫瘤組織VEGF、Endostatin表達量。

1.5 腫瘤組織凋亡基因蛋白Fas、P53表達檢測 采用流式細胞術檢測。取部分各組剝離的腫瘤組織，加入生理鹽水研磨，PBS洗滌，將細胞數密度調整為1×106～2×106個/mL。檢測Fas時加入20 μL CD95-PE后作用1 h，使用流式細胞術進行檢測，檢測P53時先加入100 μL RNAse及Tren-x100 后作用15 min，再加入(H+L)-FITC 10 μL作用15 min；0.01 mol/L PBS洗滌2次，每次2 min。采用流式細胞儀檢測腫瘤組織凋亡基因蛋白Fas、P53表達。

1.6 外周血T細胞亞群檢測 采用流式細胞術。各組處死前采用斷尾采血法取尾靜脈外周血40 μL，加入離心管中(內含6 μL EDTA-2Na)。采用流式細胞儀檢測T細胞亞群，計算CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/ CD8+。

2 結果

2.1 各組腫瘤質量及抑瘤率比較 模型組、順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤質量分別為(1.51±0.46)、(0.52±0.26)、(0.48±0.12)、(0.34±0.02)、(0.29±0.16)g；順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤質量均低于模型組(P均<0.01)；黃芪多糖中、高劑量組腫瘤質量均低于順鉑組及黃芪多糖低劑量組，且黃芪多糖高劑量組降低更明顯(P均<0.05)。順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組抑瘤率分別為49.29%、52.13%、57.32%、65.22%。

2.2 各組腫瘤組織VEGF、Endostatin及Fas、P53表達比較 見表1。

表1 各組腫瘤組織VEGF、Endostatin及Fas、P53表達比較

注:與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，△P<0.05。

2.3 各組外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比較 見表2。

表2 各組外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比較

注: 與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

3 討論

順鉑是肺癌臨床常用化療藥物，可抑制腫瘤細胞DNA復制過程，高濃度時對RNA及蛋白質合成抑制作用顯著[5]。現代藥理學認為，順鉑作用部位主要在DNA的嘧啶堿基及嘌呤基，可損傷癌細胞膜上結構，抑制癌細胞DNA復制過程[6,7]。順鉑的抗癌譜廣、作用強，但其細胞毒性導致患者在應用過程中免疫功能受到抑制，進而影響療效。目前，臨床上正積極尋找能夠配合順鉑治療惡性腫瘤的增效減毒藥物。黃芪多糖是由傳統中藥黃芪中提取的有效成分，具有增強并調節機體免疫功能的作用，可作為免疫調節或促進劑，廣泛應用于抗腫瘤、病毒、輻射、衰老、應激等方面，且效果較好[8]。本研究結果顯示，模型組腫瘤質量>順鉑組、黃芪多糖低劑量組>黃芪多糖中劑量組>黃芪多糖高劑量組，順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組抑瘤率分別為49.29%、52.13%、57.32%、65.22%，呈逐漸升高趨勢。說明黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈濃度依賴性。

VEGF是血管滲透性因子，具有促進新生血管形成的作用，其主要的生物學功能是促進血管細胞分裂及增殖，具有明顯的促有絲分裂作用[9,10]。本研究結果顯示，順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤組織VEGF表達均低于模型組，Endostatin表達均高于模型組，且黃芪多糖中、高劑量組變化更明顯；說明黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠抑瘤作用的相關機制可能與其降低VEGF表達、升高Endostatin表達有關。Endostatin是腫瘤衍生的血管生成抑制因子，具有較強的血管生成抑制作用，能抑制原發腫瘤生長、轉移[11,12]。Fas、P53是凋亡基因蛋白，具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[13,14]。本研究結果顯示，順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組腫瘤組織Fas、P53表達均高于模型組，但順鉑組及黃芪多糖低、中、高劑量組比較差異無統計學意義；表明Lewis肺癌小鼠治療過程中腫瘤組織Fas、P53表達升高為應用順鉑所導致的，與黃芪多糖是否應用關系不大。

隨著臨床對免疫學研究的不斷深入，其在腫瘤治療過程中的重要性日益受到重視。有研究表明，腫瘤發病的全過程均與宿主免疫狀態關系密切，而再腫瘤治療過程中細胞免疫起重要作用[15]。細胞免疫應答主要是T細胞介導的特異性細胞免疫，外周血CD4+及CD8+亞群正常情況下處于平衡狀態，維持機體免疫功能，如該平衡被破壞則機體即出現免疫功能低下，而CD4+/CD8+是反映機體免疫系統平衡的重要指標[16]。本研究結果顯示，黃芪多糖低、中、高劑量組外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+均高于順鉑組及模型組，而黃芪多糖低、中、高劑量組比較差異無統計學意義；說明在順鉑治療的基礎上聯用黃芪多糖可提高肺癌小鼠的免疫功能，從而增強自身抗腫瘤能力、抑制腫瘤生長。

綜上所述，黃芪多糖聯合順鉑對Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈濃度依賴性；抑制VEGF表達、提高Endostatin蛋白表達及免疫功能是其可能的機制。

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河北省高等教育學會“十二五”高等教育科學研究課題(GJXH2011-41)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.011

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A

1002-266X(2017)44-0039-03

2017-03-09)