腦挫傷后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)態(tài)觀察

張海林，李秀芬，李 娜

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 410100)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

腦挫傷后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)態(tài)觀察

張海林，李秀芬，李 娜

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 410100)

目的探討腦挫傷后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)的變化及其意義。方法以腦挫傷出血死亡者為觀察組(67例)，以病理性腦出血、顱內(nèi)出血者為對(duì)照組(52例)，應(yīng)用免疫組化親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(ABC法)，檢測(cè)兩組全腦標(biāo)本不同存活時(shí)間段神經(jīng)元和Ast的數(shù)量變化。結(jié)果挫傷后5 min至20 d觀察組神經(jīng)元低于對(duì)照組，Ast高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，且在觀察時(shí)間內(nèi)呈拋物線變化。結(jié)論神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞變化與腦挫傷的部位和經(jīng)過時(shí)間有一定關(guān)系，對(duì)腦挫傷的性質(zhì)和時(shí)間診斷與鑒別有一定意義。

腦挫傷；免疫組織化學(xué)；神經(jīng)元；星形膠質(zhì)細(xì)胞；損傷時(shí)間

神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,Ast) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要功能伙伴，其交互作用已引起腦科學(xué)專家和臨床醫(yī)師的高度關(guān)注[1]。腦挫傷后神經(jīng)元和Ast會(huì)呈現(xiàn)出顯著的特征性變化，且這種變化有一定的規(guī)律性[2]，有報(bào)道稱，癲癇的發(fā)病是神經(jīng)元性疾病，星形膠質(zhì)細(xì)胞是人腦癲癇病灶的重要組成部分[3-4]。因此，流行病學(xué)調(diào)查是證實(shí)，在70%～80%和癲癇病

表1 兩組一般資料比較

患者中星形膠質(zhì)細(xì)胞與癲癇的發(fā)病關(guān)系密切，研究神經(jīng)元和Ast動(dòng)態(tài)變化對(duì)腦挫傷的診斷、治療或預(yù)后判斷都有重要的參考價(jià)值。由于腦挫傷神經(jīng)元和Ast的病理形態(tài)學(xué)改變十分輕微，動(dòng)態(tài)觀察往往非常困難[5]。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，這一困難已逐步解決。本研究對(duì)腦挫傷和病理性出血死亡后的全腦標(biāo)本進(jìn)行神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞變化的動(dòng)態(tài)觀察，并發(fā)現(xiàn)了一些變化規(guī)律，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性研究本院2010-2016年檢測(cè)的因腦出血死亡尸檢標(biāo)本119例，年齡1～80歲；傷后或發(fā)病后存活時(shí)間5 min至20 d。其中，67例為腦挫傷出血死亡(觀察組)，損傷原因包括交通事故28例、鈍器擊傷26例、墜落傷11例、產(chǎn)傷2例；52例為非腦挫傷出血死亡(對(duì)照組)，包括病理性腦出血30例，顱內(nèi)出血22例，兩組性別、年齡、出血部位、傷(病)后存活時(shí)間，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，具有可比性，見表1。

1.2方法[6]

1.2.1取材 死后24 h內(nèi)冠狀面剖開腦組織，從出血灶中心向周圍依次取材，標(biāo)本大小為2.0 cm3×1.5 cm3×0.3 cm3。

1.2.2組織處理 對(duì)所取標(biāo)本立即用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片。

1.2.3免疫組化染色采用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(ABC法) 微波爐中5～10 min抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后加入1∶100的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP；北京中山生物技術(shù)有限公司提供)一抗體，37 ℃反應(yīng)1 h；磷酸緩沖液(PBS，武漢博士德生物工程有限公司提供)沖洗3次，每次15 min；加入神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE；北京中山生物技術(shù)有限公司提供)二抗體，37 ℃反應(yīng)30 min；PBS沖洗3次，每次15 min；3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB,北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn))顯色，室溫10 min，充分水洗；蘇木素輕度復(fù)染；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4圖像分析和(SMP)測(cè)量 在相同的放大倍數(shù)下(物鏡20倍)觀察神經(jīng)元和Ast形態(tài)，TTTY-300型掃描顯微光度計(jì)(SMP；波長(zhǎng)450 μm)測(cè)定GFAP在和NSE的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以MPIAS-500多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)(購(gòu)自同濟(jì)清平影像工程公司)計(jì)算出對(duì)照組和觀察組傷后成活2 h、3 d、7 d、10 d、15 d和20 d時(shí)神經(jīng)元和Ast的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)觀察 (1)神經(jīng)元：光鏡下，NSE染色后，對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)及軸突呈均勻棕黃色，無(wú)明顯脫染；觀察組2 h內(nèi)變化不明顯，之后神經(jīng)元胞體及細(xì)胞核縮小，染色加深并出現(xiàn)腫脹變形，隨著時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)密度減低、濃淡不一，核仁不清，最后神經(jīng)纖維呈空泡狀，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，細(xì)胞核加深或核碎裂、溶解，壞死消失。(2) 星形膠質(zhì)細(xì)胞：GFAP染色后SMP觀察，對(duì)照組Ast呈棕黃色，未見腫脹與增生；而觀察組已見明顯增生的膠質(zhì)細(xì)胞。胞體顯著腫脹，細(xì)胞質(zhì)混濁，呈深棕色，隨著時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)胞突斷裂，核擠向胞體一側(cè)，最后溶解消失。

2.2神經(jīng)元和Ast的數(shù)量變化 整體上觀察組神經(jīng)元計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，Ast計(jì)數(shù)則高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，見表2。

表2 兩組神經(jīng)元和Ast的數(shù)量比較

2.3神經(jīng)元和Ast反應(yīng)與傷后時(shí)間的關(guān)系 觀察組神經(jīng)元NSE濃度：傷后2 h為(57.63±6.86)μg/mL，隨后逐漸下降，7 d時(shí)僅(34.61±7.52)μg/mL；隨后緩慢增長(zhǎng)，但始終低于對(duì)照組的(66.43±5.61)μg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，觀察組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后2 h開始增加；3 d后進(jìn)一步增多，7 d達(dá)到高峰；以后逐漸下降，20 d后降到最低，但仍比對(duì)照組高。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，整體上呈拋物線變化軌跡，見圖1。

圖1 腦挫傷后不同時(shí)間神經(jīng)元濃度和Ast反應(yīng)比較

2.4Ast反應(yīng)與腦挫傷部位的關(guān)系 觀察組62例中，共觀察到大腦、小腦和腦干部位的挫傷灶91處，存在Ast腫脹51例，其不同部位腦挫傷周圍Ast反應(yīng)性腫脹情況見表3，腦干與大腦比較、腦干與小腦比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

表3 不同部位腦挫傷Ast反應(yīng)性腫脹比較

3 討 論

3.1動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)元和Ast反應(yīng)的意義 Ast含有許多微細(xì)交錯(cuò)排列的原纖維，不但在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)數(shù)量多、體積大、分布廣，纖維性Ast多分布在腦、脊髓白質(zhì)，原漿性Ast則多分布在腦、脊髓灰質(zhì)中；而且具有很多重要功能，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、修復(fù)與再生、改善環(huán)境、神經(jīng)免疫及各種神經(jīng)疾病病理機(jī)制中都起著重要的作用[7]。Aste 變化對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活有促進(jìn)作用，因Ast除構(gòu)成血腦屏障以及分隔、支持鄰近的神經(jīng)元外，Ast的早期聚集還可增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)低糖和缺氧的耐受性，且通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外液K1-濃度和攝取谷氨酸，表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子等多種因子和它們的受體，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用[8]，動(dòng)態(tài)觀察Ast反應(yīng)即可反映神經(jīng)元狀態(tài)[9]。研究證實(shí)，腦出血后Ast會(huì)在出血周圍反應(yīng)區(qū)發(fā)生肥大和增生性的變化，表現(xiàn)異?；钴S，這種變化對(duì)缺血性神經(jīng)元產(chǎn)生雙向作用，甚至可以說(shuō)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)就是對(duì)神經(jīng)元損傷的應(yīng)答：(1)對(duì)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)有較大保護(hù)和促進(jìn)作用，Ast構(gòu)成血腦屏障，分隔、支持鄰近神經(jīng)元，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺氧、低糖的耐受性，可幫助攝取谷氨酸，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子，維持神經(jīng)元存活[10-11]；(2)Ast也對(duì)缺血性神經(jīng)元產(chǎn)生一定的毒性作用[12]。腦挫傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素-3，從而損害的抑制缺血性神經(jīng)元[13]。本觀察中，觀察組神經(jīng)元計(jì)數(shù)顯著低于對(duì)照組，Ast計(jì)數(shù)高于對(duì)照組(Plt;0.05)，Ast反應(yīng)在大腦、小腦和腦干等多個(gè)部位的挫傷處都有反應(yīng)，進(jìn)一步證明了這一觀點(diǎn)：腦挫傷后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生與病理性腦出血不同的變化，這種變化規(guī)律的發(fā)現(xiàn)和掌握對(duì)腦挫傷的性質(zhì)和時(shí)間診斷與鑒別有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

3.2神經(jīng)元和Ast檢測(cè)方法 參照文獻(xiàn)[14]，筆者選擇免疫組化ABC-NSE和GFAP檢測(cè)神經(jīng)元和Ast，免疫組化ABC技術(shù)具有高敏感性和高特異性，這在一定程度上彌補(bǔ)了HE染色的缺陷。NSE既是神經(jīng)特異性很高的標(biāo)記物，又是神經(jīng)元分化的標(biāo)志酶，腦挫傷后神經(jīng)元會(huì)逐步溶解消失，神經(jīng)元存活，NSE反應(yīng)呈陽(yáng)性，反之，神經(jīng)元變性和壞死，NSE則呈陰性或弱陽(yáng)性[15]。Ast源于成膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的中間絲，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架，能反映Ast的新陳代謝，已被公認(rèn)為是Ast的標(biāo)記蛋白[16]。NSE和GFAP抗體與抗原的特異性結(jié)合，能更清楚地顯示腦組織中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，更有利于進(jìn)行定量分析[17]，本實(shí)驗(yàn)觀察到腦挫傷后NSE染色減弱、GFAP染色增強(qiáng)，其變化在時(shí)間和挫傷部位方面還呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。這進(jìn)一步證實(shí)免疫組化ABC-NSE和GFAP技術(shù)是從數(shù)量上和形態(tài)方面推斷腦挫傷性質(zhì)、部位和存活時(shí)間的一種可靠方法。

3.3腦挫傷形態(tài)學(xué)變化與存活時(shí)間推斷 腦挫傷后神經(jīng)元和Ast會(huì)在數(shù)量上和形態(tài)出現(xiàn)不同變化，傷后1～2 h，局部出血、水腫，Ast呈輕度反應(yīng)，神經(jīng)元開始變性、壞死，隨時(shí)間延長(zhǎng)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，陽(yáng)性染色加深，神經(jīng)元浸潤(rùn)、變性、自溶、壞死相應(yīng)增多；7 d左右反應(yīng)達(dá)到高峰，以后雖有所回落，但仍有明顯特征[18]。本研究發(fā)現(xiàn)人腦挫傷后NSE呈倒拋物線樣變化，GFAP表達(dá)呈拋物線樣變化，進(jìn)一步證實(shí)通過免疫組織化學(xué)染色后觀察腦組織神經(jīng)元和Ast反應(yīng)變化，可以推斷腦挫傷存活時(shí)間，從形態(tài)學(xué)角度反映、揭示腦組織損傷后細(xì)胞變性死亡到修復(fù)的病理學(xué)演變規(guī)律[19]，這種反?，F(xiàn)象可能是損傷后缺血、缺氧，細(xì)胞反應(yīng)減低抑制蛋白質(zhì)合成，致NSE和GFAP含量變化的結(jié)果[20]。本研究發(fā)現(xiàn)腦挫傷2 h后其周圍組織星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)呈拋物線樣變化，隨時(shí)間延長(zhǎng)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，陽(yáng)性染色加深；腦出血7～15 d星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)達(dá)高峰。其變化對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活可能有促進(jìn)作用，在出血周圍反應(yīng)區(qū)發(fā)生肥大和增生性變化，星形膠質(zhì)細(xì)胞除構(gòu)成血腦屏障以及分隔、支持鄰近的神經(jīng)元外，在腦出血周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的早期聚集可增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)低糖和缺氧的耐受性[21]?？梢姡@種腦挫傷形態(tài)學(xué)變化與存活時(shí)間推斷對(duì)法醫(yī)學(xué)鑒定、對(duì)腦挫傷、腦出血的診斷、治療或預(yù)后判斷都有重要的參考價(jià)值。

總之，腦挫傷后神經(jīng)元和Ast會(huì)在數(shù)量上和形態(tài)出現(xiàn)不同變化，ABC-NSE和GFAP檢測(cè)神經(jīng)元和Ast的一種可靠方法。神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞變化與腦挫傷的部位和經(jīng)過時(shí)間有一定關(guān)系。由于所選樣本例數(shù)偏少，所得結(jié)果可能會(huì)存在偏差，在實(shí)際鑒定工作中驗(yàn)證，還需要應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探索腦挫傷后Ast的性質(zhì)和時(shí)間的鑒別診斷。

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張海林(1974-)，主治醫(yī)師、講師，本科，主要從事神經(jīng)病學(xué)方面的研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.035

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1671-8348(2017)32-4576-04

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