高通量測序分析miRNAs在胃癌新鮮組織與石蠟包埋組織中的表達

曾文泓，王麗華，唐 丹

(1.江西中醫藥大學基礎醫學院，江西南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大學第一附屬醫院老干科，江西南昌 330006)

·技術與方法·

高通量測序分析miRNAs在胃癌新鮮組織與石蠟包埋組織中的表達

曾文泓1，王麗華2△，唐 丹3

(1.江西中醫藥大學基礎醫學院，江西南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大學第一附屬醫院老干科，江西南昌 330006)

目的利用二代測序技術對FFPE標本進行高通量測序及相關的生物信息學分析，探討miRNAs在來源于石蠟包埋胃癌組織(FFPE)中的標本檢測的可靠性，探討其臨床意義。方法選取2015年和2016年2例胃癌患者手術切除同一組織的FFPE和新鮮冰凍標本，從標本中提取RNA并分離構建small RNA文庫，采用Illumina測序平臺測序的方法對其進行高通量測序，統計各已知miRNAs家族序列的表達量，構建已知miRNAs表達譜，對標本miRNAs進行Spearman相關性分析，評估miRNAs表達量的差異變化情況。結果新鮮冰凍標本中提取的總RNA質量較高，RNA保存度完整，顯示28S是18S的1.3～1.4倍，從石蠟組中提取的RNA，結果顯示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明顯，miRNAs表達譜在冰凍和FFPE標本中，Spearman相關系數分別為0.90和0.86，兩者miRNAs表達量較一致，具有相關性。結論FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性，且可通過二代測序進行腫瘤標本檢測。

胃腫瘤；miRNA；甲醛固定石蠟包埋；二代測序

胃癌是消化系統疾病中常見的惡性腫瘤之一[1]，最近大量的研究表明miRNAs在胃癌的發生、發展中起著重要的作用，參與著胃癌形成的多條信號通路，同時miRNAs被發現在腫瘤分期、分級、預后及藥物的靶向治療分析等方面具有巨大的潛力[2]。目前，新一代高通量測序已成為基因表達定量檢測強有力的工具，特別是在定量低豐度的miRNAs研究及揭示微小的基因表達變化等領域有很大的優越性。為了研究miRNAs在來源于石蠟包埋胃癌組織標品檢測的可靠性，本研究從FFPE標本中分離并構建small RNA文庫，采用Illumina測序平臺的邊合成邊測序的方法對其進行高通量測序，結合生物信息學，驗證該方法的可行性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取了江西中醫藥大學附屬醫院2015年和2016年2例胃癌患者的手術切除標本，手術標本經病理學檢測分別由兩位臨床醫師進行確診，并采集相關病理資料。腫瘤位置以病理組織報告為準，腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移情況分別參照國際抗癌聯盟標準(UICC)分類、WHO標準評判[3]。首先用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗取下的胃癌組織標本，把標本用組織剪剪切至0.5 mm左右大小，迅速放入液氮罐中進行冷凍待用(-80 ℃)，隨后將余下部分用10%甲醛固定后石蠟包埋，歸檔存放于溫室。取病理科石蠟包埋標本，無菌操作常規切片，切片厚度約10 μm，每2～3片放入1個1.5 mL的滅菌EP管中。

1.2方法

1.2.1RNA提取 于-80 ℃保存的新鮮標本在液氮中研磨至粉末狀，加入Trizol試劑(Ambion，#AM12183555)混勻，按照Trizol試劑說明書提取總RNA。使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion,#AM1975)處理甲醛固定石蠟包埋的標本，按照說明書進行核酸提取，在純化柱上消化DNA后洗脫得到RNA。

1.2.2Small RNA文庫的構建及測序 總RNA用15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，回收純化18～30 nt的部分，在T4 RNA連接酶的作用下連接RNA Adapter，所得的產物經過RT-PCR擴增之后采用Illumina高通量測序平臺進行測序。

1.2.3測序數據基本分析 Illumina測序平臺的測序數據經過如下流程進行分析：(1)去除測序質量較低的序列，去除RNA Adapter污染的序列，去除沒有目的片段的序列，去除包含polyA的序列和去除小于18 nt的小片段序列，得到高質量序列，對其進行長度分布統計。(2)將小RNA序列與基因組進行比對，將其定位到基因組，分析小RNA在基因組上的表達和分布情況。(3)將小RNA序列與GenBank數據庫及Sanger中心的Rfam數據庫中的ncRNA(非編碼RNA)分別進行分析比對，去除rRNAs，scRNAs，snoRNAs，snRNAs和tRNAs。(4)將小RNA比對到mRNA的外顯子和內含子，找出來自mRNA降解的片段。(5)將過濾后的序列進行互相比對，找出可以互補、符合siRNA結構特征的小RNA，作為可能的siRNA候選者。(6)通過與miRBase數據庫中的所有人miRNAs進行比對分析，識別miRNAs序列。(7)統計各已知miRNAs家族序列的表達量，構建已知的miRNAs表達譜。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計學分析，將石蠟包埋的標本獲得miRNAs表達量與新鮮組織獲得的miRNAs進行Spearman相關性分析，評估miRNAs表達量的差異變化情況，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1RNA提取結果 臨床手術切除組織標本的一般信息：2例胃癌患者的年齡分別為56和61歲，男1例，女1例。從兩份標本經過檢測提取的總RNA結果顯示發現，保存在液氮組中提取的總RNA質量較高，RNA保存度完整，顯示28S是18S的1.3～1.4倍，符合完整度要求28S是18S的1～2倍范圍。從石蠟組中提取的RNA結果顯示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明顯，見圖1。

2.2胃癌小RNA 分析胃癌FFPE標本和新鮮標本的miRNAs，用Illumina高通量測序平臺對標本進行測序，并構建小RNA文庫，去除接頭并過濾低質量數據。結果小RNA序列長度分布在10～35 nt，其中22 nt的序列小RNA居多(圖2)隨后排除掉小于18 nt的序列后，得到了最終目標序列(表1)。將這些小RNA與Rfam、miRBase、GenBank,進行比對，同時將小RNA序列兩兩比對以尋找siRNA，最后進行了注釋(表2)。

圖1 Agilent 2100檢測RNA質量

A：Frozen-1；B：FFPE-1；C：Frozen-2；D:FFPE-2

圖2 小RNA長度分布圖

表2 比較分別在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA檢測結果[n(%)]

續表2 比較分別在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA檢測結果[n(%)]

2.3高通量測序miRNAs表達譜 通過檢測兩對不同年份的同一胃癌組織冰凍標本和FFPE標本進行高通量測序，miRNAs表達譜在冰凍和FFPE標本中，Spearman相關系數分別為0.90和0.86(圖3)。

A:2015年；B:2016年

圖3同一胃癌組織不同時間冰凍標本與FFPE標本中小RNA的Spearman相關分析

3 討 論

miRNAs是臨床醫學研究中新興的熱點分子，參與疾病的信號通路，從而對疾病的發生、發展及治療有重要作用[4]。從現階段研究發現miRNAs可作為抑癌基因或者癌基因參與胃癌發展的某個階段，它可與其他抑癌基因、癌基因及凋亡相關基因產生相互作用影響胃癌的進程。由于其多功能性特點使它在胃癌的標志物診斷和治療方面有巨大的應用潛力，有利于提高胃癌的早期診斷率[5-6]。目前鑒定和確證腫瘤分子標志物需要大量的臨床標本，而低溫冰凍組織和FFPE組織標本是生物醫學研究中重要和廣泛的標本來源，很多醫院病理科及醫療研究所都有大量的存檔。從相關組織中提取RNA或者DNA來獲得疾病相關的基因表達信息，進行疾病前瞻性、回顧性研究，鑒別不同疾病臨床特征和預后轉歸有關的差異表達基因，篩選出作用的靶基因，分析疾病的調控機制路徑等，這是目前研究相關疾病在分子水平的普遍做法，但經過甲醛固定處理過的石蠟包埋塊標本經歷了長時間的保存，其內部發生了核酸與蛋白質交聯反應，單甲基化基團的修飾等，RNA不可避免地發生降解，對標本總RNA提取及下游逆轉錄和基因表達定量分析產生影響。

本研究發現提取冰凍組織和FFPE組織標本獲得一定質量的RNA，可以達到進一步分子生物學檢測的要求[7-9]。通過高通量測序2對不同年份的同一胃癌組織冰凍標本和FFPE標本，miRNAs表達譜在冰凍和FFPE標本中，Spearman相關系數分別為0.90和0.86，兩者miRNAs表達量較一致，具有相關性，研究還顯示組織標本的RNA降解、片段化程度基于標本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發生變化，同一胃癌組織不同保存年份中的冰凍組織標本和FFPE組織標本的RNA，冰凍組織中提取的總RNA質量比FFPE組織的要高，FFPE保存方法其RNA的降解程度比冰凍的要多，不同保存時間的冰凍標本RNA的降解會逐漸增加。FFPE標本中分離到的核酸比新鮮標本或冰凍標本的相對分子質量更低，石蠟組織標本提取的RNA通常會有一定的降解或甲醛修飾，而miRNAs分子的大小通常只有20～22 bt，自身片段短優勢可以避免被修飾和酶的破壞降解[10]。由于活體細胞中miRNAs只有極少數處于游離狀態，且可能miRNAs通過RNA誘導沉默復合體(RISC)靶向結合mRNA，發揮阻遏轉錄后翻譯功能或降解RNA的作用，miRNAs受到RISC復合體的保護，所以石蠟組織中的大部分miRNAs未被修飾[11]，而在研究檢測不同的臨床標本中，具有高度的穩定性和重復性是作為有價值的腫瘤候選標志物的一個重要特點，因此選擇miRNAs作為腫瘤候選標志物具有一定的臨床意義[12]。本研究顯示通過二代測序技術可以利用石蠟組織標本研究miRNAs在疾病中的作用，這為后期大樣本腫瘤標志物研究篩選提供了很好的基礎，可能為解決樣本量不足及檢測方案的選擇提供幫助。

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HighthroughputsequencinganalysisofmiRNAsexpressioninfreshgastriccancertissuesandparaffinembeddedtissues*

ZengWenhong1,WangLihua2△,TangDan3

(1.SchoolofBasicMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330004,China;2.DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330006,China; 3.DepartmentforGeriatricDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330004,China)

ObjectiveTo analyze formalin-fixed and paraffin-embedded(FFPE) sample by next generation sequencing(NGS) technology for high throughput DNA sequencing and related bioinformatics analysis,and to explore the reliability and clinic significance of miRNAs in the detection of sample from FFPE gastric cancer tissue.MethodsFFPE and fresh frozen samples of the same tissue were excised from 2 cases of gastric cancer in 2015 and 2016.RNA was extracted from the samples and the small RNA library was isolated and constructed,and high throughput DNA sequencing was conducted with Illumina sequencing platform.The DNA sequencing results were analyzed by quantifying the expression of known miRNAs families sequence,and the expression profiling of known miRNAs was constructed.Spearman correlation analysis was performed on the miRNAs of the samples to assess the difference in the expression of miRNAs.ResultsThe total RNA extracted from the fresh frozen sample had higher quality and complete RNA coverage,and the results showed that the 28S was 1.3-1.4 times of 18S.The RNA extracted from the FFPE sample showed different degrees of degradation,and the peaks of 28S and 18S were not significant.The spearman correlation of miRNAs expression profiling in frozen and FFPE samples was 0.90 and 0.86 respectively,and the expression levels of miRNAs in two samples were consistent and had significant correlation.ConclusionmiRNAs in FFPE sample can retain certain level of integrity and can be used in tumor test by NGS.

gastric neoplasms; miRNAs; formalin-fixed and paraffin-embedded; next generation sequencing

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.025

江西省衛生計生委科技計劃項目(20175539、20155389)。

曾文泓(1984-)，講師，碩士，主要從事臨床基礎研究。△

，E-mail：89463632@qq.com。

R35

A

1671-8348(2017)32-4550-03

2017-04-20

2017-09-21)