套線技術制備小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型

賈中申，蔣 智，李安潔，吳玥婷，韋 方

(貴州醫科大學附屬人民醫院心內科，貴陽 550002)

·技術與方法·

套線技術制備小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型

賈中申，蔣 智，李安潔，吳玥婷，韋 方△

(貴州醫科大學附屬人民醫院心內科，貴陽 550002)

目的提高小鼠心肌缺血再灌注損傷(I/R)模型的手術速度和可靠性。方法比較3種模型技術的手術時間和小鼠存活率，檢測術后白細胞計數和血清IL-6水平評估炎性反應，用TTC/Evans blue染色評估梗死面積，用壓力導管檢測左心室舒張末壓和壓力變化速率評估心功能。傳統技術在氣管插管呼吸機輔助通氣支持下開胸結扎、松開左冠狀動脈(LCA)；新型技術用異氟烷吸入麻醉，經胸壁擠出心臟活結結扎LCA，抽開活結松開LCA；套線技術同樣經胸壁擠出心臟，但用方結同時結扎LCA及1根2-0尼龍線，之后抽出該尼龍線松開LCA。結果與傳統技術比較，新型技術和套線技術總手術時間明顯縮短(Plt;0.01)，血白細胞計數和血清IL-6水平降低(Plt;0.01或Plt;0.05)，小鼠存活率提高(Plt;0.05)；與新型技術比較，套線技術簡化手術操作并縮短總手術時間(Plt;0.01)。3組小鼠心臟梗死面積和心功能差異無統計學意義(Pgt;0.05)，但套線組和傳統組的變異系數低于快速組。結論套線技術降低手術難度，較新型技術進一步縮短手術時間并提高了小鼠I/R模型的穩定性。

心肌梗死；心肌缺血；心肌再灌注損傷；動物模型；小鼠，近效C57BL

急性心肌梗死是威脅我國人民健康的重要疾病[1]。急診再灌注治療可有效減少心肌梗死面積[2]，但再灌注后缺血心肌的損傷反而可能進一步加重，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,I/R)[3]。如何防治I/R保護缺血心肌已成為急性心肌梗死治療中亟待解決的問題[4]。深入理解I/R發病機制，積極尋找治療靶點并設計相應藥物對進一步改善急性心肌梗死患者的預后具有重要意義[5]，而I/R動物模型的成功建立是基礎研究的基礎[6]。小鼠在基因水平與人類具有高度同源性[7]，易飼養，繁殖快，飼養費用低，個體差異小，是基礎研究中重要的疾病模型動物[8]。傳統技術制作小鼠I/R模型需在氣管插管呼吸機輔助通氣下開胸結扎左冠狀動脈(LCA)，待缺血時間后松開LCA再灌注[9]。該手術步驟繁瑣、耗時，模型死亡率高。近年來報道了新型小鼠I/R手術技術，在面罩吸入麻醉下將心臟擠出胸腔，用活結結扎LCA，再松開活結再灌注[10]。活結結扎是該技術的關鍵步驟，但活結的松緊程度完全依賴術者經驗和手感：如活結過緊可能無法松開再灌注；如活結過松可能提前松開再灌注。如術者訓練不足，可導致原始數據離散度過大，對解釋實驗結果造成極大困擾，不能準確揭示干預措施對I/R的影響。本研究用套線法克服了新型技術的難點，使再灌注時間點更加可靠，手術時間進一步縮短，模型結果更加穩定。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性C57/B6小鼠，8～12周齡，體質量25 g左右，來源于成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2015-2016]，依托貴州醫科大學附屬醫院臨床研究中心[SCXK(黔)2012-0001]，嚴格遵守實驗動物3R原則。160只小鼠分為對照組10只，傳統組、新型組和套線組各50只。

1.2主要儀器和試劑 小動物麻醉機、小動物呼吸機(瑞沃德，中國深圳)，異氟烷(玉研生物，中國上海)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑(Sigma，美國)，Evans blue (Sigma，美國)，6-0圓針絲線(Sharpoint，美國)，4-0三角針編織線、2-0尼龍線(金環，中國上海)，戊巴比妥(普博斯生物，中國北京)，小鼠白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(博士德，中國武漢)，0.9 F光纖壓力導管、換能器(FISO，加拿大)，多通道生理信號記錄儀、LabScribe軟件(iWorx，美國)。

1.3方法

1.3.1小鼠I/R模型手術方法 (1)對照組：不進行手術操作。(2)傳統組：用1%戊巴比妥鈉溶液(0.055 mL/10 g)腹腔注射麻醉，經口氣管插管連接小動物呼吸機輔助通氣(100次/分，潮氣量0.5 mL，吸呼比2∶1)[11]，沿胸骨左緣4、5肋間逐層剪開胸壁分離心包暴露LCA，在距肺動脈根部下緣2 mm用活結結扎LCA，持續呼吸機輔助通氣30 min后抽松活結[12]。(3)新型組：用2%異氟烷吸入麻醉，沿劍突至左側腋窩將皮膚剪開，鈍性分離胸大肌、胸小肌，用血管鉗從第4～5肋間心尖搏動最強處插入胸腔，撐開肋間隙將心臟擠出，于肺動脈根部下方2 mm用活結結扎LCA，將心臟送回胸腔，活結線頭留在胸腔外，荷包縫合皮膚，30 min后再次麻醉后抽松活結[10,13]。(4)套線組：同新型組，但擠出心臟后用方結將LCA和1根5 cm的2-0尼龍線一起結扎，尼龍線兩端留于胸腔外，荷包縫合皮膚，30 min后直接抽出尼龍線。見圖1A。

1.3.2手術計時 從麻醉開始至結扎LCA后完成縫合皮膚為缺血手術時間，再次麻醉至松開LCA后完成縫合皮膚為再灌注手術時間，總手術時間=缺血手術時間+再灌注手術時間(圖1B)。

A：3種技術結扎LCA的關鍵手術步驟；B：手術步驟及計時方案示意圖

圖1手術方法及研究設計

1.3.3TTC/Evans blue染色 小鼠麻醉后于原位再次結扎LCA，經升主動脈灌注2% Evans blue溶液，剪下心臟于-20 ℃冰凍15 min，沿長軸間隔1 mm切片，PBS洗凈后浸入37 ℃ 2% TTC溶液20 min，4%多聚甲醛溶液固定10 min，壓平、拍照。用image pro plus軟件分別計算各切片的左心室面積(LV)、AAR面積和IA面積。非藍染區域為危險區(AAR)，白色區域為梗死區(IA)。梗死面積(IA/AAR%)=IA總和/AAR總和×100%危險區面積(AAR/LV%)=AAR總和/LV總和×100%[14]。

1.3.4白細胞計數 用1 mL注射器(含100 U肝素)穿刺心臟采血放入EP管中[15]，用Beckman AcT 5 diff全自動血細胞分析儀測定白細胞計數。

1.3.5血清IL-6測定 小鼠血樣4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上層血清用ELISA法測定IL-6濃度，按說明書操作(博士德，中國)。

1.3.6心臟血流動力學檢測 連接壓力導管、換能器、多通道生理信號記錄儀和電腦，設置采樣頻率5 000 Hz，校零。小鼠用異氟烷吸入麻醉，將0.9 F光纖壓力導管經右頸動脈送入左心室記錄壓力波形，用LabScribe計算心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室壓力變化最大速率(dp/dtmax)和最小速率(dp/dtmin)[16]。

2 結 果

2.1不同粗細尼龍線比較 測試了4-0、3-0和2-0尼龍線，用方結結扎LCA和尼龍線后立即抽出尼龍線，24 h后行心臟TTC/Evans blue染色(圖2)。4-0和3-0尼龍線抽出后方結仍可繼續阻斷LCA使心肌持續缺血壞死變薄(白色區域)，而2-0尼龍線抽出后未見明顯壞死區，LCA可恢復有效血流使心肌存活(紅色區域)，在方結內至少預留0.07～0.09 mm2(2-0線直徑為0.300～0.339 mm)才能在抽線后使LCA恢復有效血液灌注。

圖2 套線技術應用不同規格尼龍線對再灌注的影響

2.2手術時間比較 因無需氣管插管、逐層開胸、逐層縫合等手術操作，新型組和套線組總手術時間較傳統組縮短(Plt;0.01)，見圖3A。與新型組比較，盡管套線組缺血手術時間增加(Plt;0.01)，但再灌注手術操作簡化，再灌注手術時間縮短(Plt;0.01)，總手術時間縮短(Plt;0.01)，見圖3B。

a：Plt;0.01，與傳統組比較；b：Plt;0.01，與新型組比較

圖3 3種技術手術時間

2.3炎性反應比較 與對照組比較，3組I/R小鼠術后24 h血白細胞計數和血漿IL-6水平均升高(Plt;0.01)，見圖4。但與傳統組比較，新型組和套線組小鼠術后血白細胞計數和血漿IL-6水平降低(Plt;0.05，Plt;0.01)。新型組和套線組比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

2.4存活率比較 術后24 h新型組小鼠存活率高于傳統組(Plt;0.05)，套線組存活率亦較傳統組有升高趨勢(P=0.065)；術后28 d新型組及套線組小鼠存活率較傳統組高(Plt;0.05)，見圖5。術后24 h至28 d新型組與套線組存活率差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

A:對照組；B:傳統組；C：新型組；D：套線組；a：Plt;0.01，與對照組比較；b：Plt;0.01，c：Plt;0.05，與傳統組比較

圖4 3種技術對炎性反應的影響

a：Plt;0.05，與傳統組小鼠術后28 d累計生存率比較

圖5 3種技術對生存率的影響

2.5梗死面積比較 術后24 h心臟TTC/evans blue染色(圖6A)顯示3組I/R小鼠心臟危險區面積差異不明顯(圖6B)，提示結扎LCA引起的缺血面積一致，梗死面積差異不明顯(圖6B)。但傳統組和套線組梗死面積變異系數(CV)明顯小于新型組(19.4%vs.34.7%；18.3%vs.34.7%)。

2.6血流動力學比較 術后1周4組小鼠HR差異無統計學意義，提示麻醉深度一致。與對照組小鼠比較，3組I/R小鼠LVEDP升高，dP/dtmax和dP/dtmin絕對值降低，提示心功能受損，組間差異無統計學意義(Pgt;0.05)。與新型組比較，傳統組和套線組心功能指標CV更小(表1)，傳統技術和套線技術制備模型的心功能離散度小。

A：術后24 h小鼠心臟TTC/evans blue染色；B：危險區面積和梗死面積

圖6 3種技術對梗死面積的影響

a：Plt;0.01，b：Plt;0.05，與對照組比較

3 討 論

套線技術創傷小、存活率高，再灌注手術操作較新型技術簡便可靠，總手術時間進一步縮短，制備的I/R小鼠梗死面積和心功能指標更加穩定。

本研究用術后24 h血白細胞計數和血漿IL-6濃度評估術后炎性反應[17]，研究結果提示新型技術和套線技術較傳統技術顯著減低炎性反應。除I/R外，麻醉方式[18]，手術創傷，氣管插管呼吸機介導氣道損傷[19]，術后感染、出血、疼痛[20]，均可引起嚴重全身炎性反應。傳統技術腹腔注射麻醉通常難以控制麻醉深度和時間，需氣管插管呼吸機輔助通氣支持，逐層剪開皮膚、肌肉、胸壁，損傷左側胸膜，長時間暴露胸腔內臟器，感染、出血風險高。而新型技術和套線技術采用吸入麻醉，易控制麻醉深度和時間，無需氣管插管，保留胸肌，直接從肋間破入心包腔擠出心臟，不損傷胸膜，臟器暴露時間短，出血、感染風險低。

傳統技術和新型技術均用Sharpoint 6-0絲線活結結扎LCA。筆者的經驗是傳統技術小鼠持續麻醉開胸，能保證活結扎緊LCA，但新型技術將心臟送回胸腔后縫合皮膚，活結隨心臟搏動與鄰近臟器摩擦可能松開，小鼠醒后活動可能拉扯留于體外線頭使活結松開，影響I/R可靠程度。套線技術用方結同時結扎LCA和1根2-0尼龍線阻斷LCA血流，30 min后從體外抽出2-0尼龍線使LCA再灌注。與新型技術比較有如下優勢：(1)方結牢固不松脫，LCA血流阻斷可靠；(2)尼龍線表面光滑易抽出，LCA再灌注可靠；(3)套入、抽出尼龍線技術簡單，活結技術需大量訓練積累經驗和手感。本研究顯示套線技術的梗死面積和心功能指標較新型技術離散度更小，數據更加集中，有利于減少研究樣本量，節省時間和經費。

本研究均為單人手術計時，盡管增加套入尼龍線操作延長小鼠心肌缺血手術時間，但術者稍加練習均能在30 s內完成胸腔外心臟手術，手術即刻死亡率與新型技術比較無顯著差異。如有助手配合在結扎LCA時送入尼龍線，缺血手術時間與新型技術相當。另一方面，新型技術再灌注手術操作需再次麻醉小鼠，抽松活結同樣依賴手感，部分模型需剪開皮膚線結操作方能松開活結，但套線技術無需麻醉小鼠可直接抽出尼龍線，大大簡化再灌注手術步驟，總手術時間較新型技術縮短近50%。

總之，本文套線法改良小鼠I/R模型技術和現有造模技術相比快速高效，存活率高，技術難度降低，造模結果穩定，值得推廣應用，尤其應用珍貴小鼠和昂貴實驗耗材的基礎研究更具優勢。

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Preparationofmyocardialischemia/reperfusioninjurymodelbyoverlappinglineinmice*

JiaZhongshen,JiangZhi,LiAnjie,WuYueting,WeiFang△

(DepartmentofCardiology,theAffiliatedPeople′sHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550002,China)

ObjectiveTo improve the operation speed and reliability of the myocardial ischemia/reperfusion injury(I/R) model in mice.MethodsThe operative time and the survival rate of the three models were compared.The postoperative leukocyte count and serum IL-6 level were detected to evaluate the inflammatory response.The infarct size was assessed by TTC/Evans blue staining.The left ventricular end diastolic pressure and the pressure change rate were measured by a pressure catheter for the evaluation of cardiac function.In traditional method,open chest surgery was performed to ligate and loose the left coronary artery(LCA) under the assistance of intubation and ventilation.In novel method,isoflurane was used for anesthesis,and then heart was squeezed out of the chest to ligate and loose LCA with a slipknot.In overlapping line method,the heart was also squeezed out,but a square knot was performed to ligate LCA and a 2-0 nylon together,and then the nylon thread was drew out to loose LCA.ResultsCompared with traditional method,the novel method and overlapping line method had significant short operation time(Plt;0.01 orPlt;0.05),less white blood cell count and serum IL-6 concentration(Plt;0.05) and higher mice survival rate(Plt;0.01);compared with novel method,the overlapping line method further simplified the reperfusion procedure and decreased total procedure time(Plt;0.01).There was no significant difference in cardiac infarct size and cardiac function by using the three methods(Pgt;0.05),but the overlapping line method had less coefficient of variation compared to novel method.ConclusionCompared with the novel method,the overlapping line method reduces the operation difficulty,shortens the operation time and improves the stability of I/R model.

myocardial infarction;myocardial ischemia;myocardial reperfusion injury;animal model;mice,inbred C57BL

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.024

國家自然科學基金地區科學基金資助項目(81460050);貴州省科技廳科學技術基金[黔科合J字(2014)2112號]。

賈中申(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事心肌保護方面的研究。△

，E-mail:weifanggzsy@qq.com。

R-331

A

1671-8348(2017)32-4546-04

2017-04-08

2017-06-17)