風濕性心瓣膜病心房顫動患者心房組織纖維化重構與TGF-β1表達的相關性研究

肖祥彬,劉 麗,劉婷婷,李 奎,雷開健,常光磊

(1.四川省宜賓市第二人民醫院心血管內科 644000；2.四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤分子醫學實驗室 644000；3.重慶醫科大學附屬第一醫院心血管內科 400016)

·論著·臨床研究

風濕性心瓣膜病心房顫動患者心房組織纖維化重構與TGF-β1表達的相關性研究

肖祥彬1,劉 麗1,劉婷婷1,李 奎1,雷開健2,常光磊3

(1.四川省宜賓市第二人民醫院心血管內科 644000；2.四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤分子醫學實驗室 644000；3.重慶醫科大學附屬第一醫院心血管內科 400016)

目的探討風濕性心臟病(風心病)心房顫動(房顫)患者心房組織纖維化重構及其可能機制。方法收集四川省宜賓市第二人民醫院2013年10月至2015年10月風濕性心瓣膜病行二尖瓣置換術或先天性心臟病開胸修補術患者的臨床資料和右心房組織標本，分為竇性心律組(RHD-SR組)、陣發性房顫組(RHD-pAF組)、持續性房顫組(RHD-cAF組)，以行先天性心臟病開胸修補術且為竇性心律組(CHD-SR組)。普通光鏡下觀察各組患者心房組織結構，苦味酸天狼猩紅染色偏振光顯微鏡分析各組Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分數(CVF)及Ⅰ/Ⅲ型CVF比值，Western blot及逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組TGF-β1的表達。結果RHD-cAF組患者左心房內徑(LAd)明顯大于RHD-SR組(Plt;0.05)，其余臨床資料各組比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)?？辔端崽炖切杉t染色提示膠原分布于心肌間質中，Ⅰ、Ⅲ型CVF及其比值在CHD-SR組、RHD-SR組、RHD-pAF組和RHD-cAF組逐漸升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)。TGF-β1蛋白和mRNA的表達在CHD-SR組、RHD-SR組、RHD-pAF組和RHD-cAF逐漸增加。結論心房組織纖維化重構是風濕性心瓣膜病患者房顫的重要機制，TGF-β1高表達可能參與心組織房纖維化重構。

風濕性心瓣膜臟??；心房纖維化；心房顫動；轉化生長因子β1

心房顫動(房顫)是臨床常見心律失常之一，是最嚴重的房性心律失常，約占住院心律失常患者的1/3。房顫是導致血栓栓塞，心力衰竭及生活質量低下等的重要原因，嚴重威脅患者的生命與健康，由于其發病機制尚未完全清楚，目前無特別有效的治療手段。越來越多的研究表明心房組織纖維化重構是房顫發生、維持及進展的重要機制之一[1]。國內外基礎和臨床研究提示，轉化生長因子β1(TGF-β1)信號轉導機制與組織纖維化等密切相關[2]。本試驗研究風濕性心瓣膜病房顫患者心房組織纖維化重構及TGF-β1在蛋白和基因水平的表達情況，探索房顫患者心房組織纖維化重構的機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年10月至2015年10月四川省宜賓市第二人民醫院風濕性心瓣膜病行二尖瓣置換術或先天性心臟病開胸修補術患者的臨床資料和右心房組織標本，有效病例共102例，所有符合入選條件的患者均簽署知情同意書。按照心律特點分為分為竇性心律組(RHD-SR組) 18例，陣發性房顫組(RHD-pAF組)21例，持續性房顫組(RHD-cAF組)42例，以行先天性心臟病開胸修補術且為竇性心律組(CHD-SR組)21例。排除標準：高齡患者(gt;65歲)；合并癥狀明顯的呼吸道感染者；甲亢或甲低者；高血壓3級者；冠狀動脈血管三維成像或冠狀動脈造影提示左前降支(LAD)、回旋支(LCX)或右冠狀動脈(RCA)狹窄70%以上者；擴張型心肌病者；慢性肺源性心臟病者；合并全身結締組織疾病者。本研究經醫院倫理委員會審批。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集 收集研究對象性別、年齡、發病史、家族史、體格檢查、心電圖、心臟彩超等資料。

1.2.2標本采集 具有心胸外科手術指征并符合入選條件的患者在體外循環下行二尖瓣置換術或先天性心臟病開胸修補術。打開右心房后立即切去300 mg左右的右心耳組織，去掉脂肪組織，并用生理鹽水洗盡血跡后分成兩部分。一部分錫紙包裹，液氮保存30 min，然后轉入-80 ℃冰箱冷凍保存；另一部分4%甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋切片(5～6 μm)，HE或苦味酸天狼貍紅染色，樹膠封固。

1.2.3組織病理學檢查 石蠟切片HE染色，普通光鏡下觀察心房組織結構。

1.2.4苦味酸天狼猩紅染色 以0.1 g天狼猩紅溶解于100 mL苦味酸飽和液配制成苦味酸天狼猩紅染色液；石蠟切片脫蠟至水，于苦味酸天狼猩紅染色液浸染1 h，脫水及二甲苯透明，樹膠封固。根據在偏振光顯微鏡下雙折光強度和顏色可以鑒別Ⅰ型和Ⅲ型膠原：Ⅰ型膠原纖維呈很強的雙折光性，排列緊密，粗大，呈亮紅色或桔黃色；Ⅲ型膠原呈弱折光性，排列成網狀，纖細，呈綠色。在鏡下不含血管區域隨機選取6個視野，Image Pro Plus 4.0病理圖像分析軟件計算兩種膠原容積百分比，并分別求其平均值，即膠原容積分數(CVF)，進一步計算Ⅰ型/Ⅲ型CVF比。

1.2.5Western blot檢測TGF-β1蛋白表達 磷酸化蛋白裂解液提取蛋白并測定蛋白樣品濃度；配制SDS-PAGE凝膠并取適量蛋白樣品，經SDS-PAGE緩沖液100 ℃預熱5 min蛋白充分變性。上樣與電泳分離：冷卻至室溫并將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內，設置電壓100 V，電泳時間100 min。轉膜：在冰浴中使用PVDF膜(FFP36/FFP39)，設置轉膜電流400 mA，轉膜時間為30 min。漂洗與封閉：蛋白膜Western洗滌液(P0023C)漂洗2 min，吸盡洗滌液，并加入封閉液，置于搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min。一抗孵育：按照操作說明步驟，Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗，4 ℃搖床緩慢搖動孵育1 h，Western洗滌液(P0023C)緩慢搖動洗膜3次。二抗孵育：按比例使用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，4 ℃緩慢搖動孵育1 h，Western洗滌液(P0023C)緩慢搖動洗滌3次。DAB顯色。Bio-Rad凝膠成像系統分析：β-actin為參考條帶，測定條帶吸光面積積分比值，計算目的條帶/β-actin條帶值，并對目的蛋白進行分析。

1.2.6逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測TGF-β1mRNA的表達 總RNA提取：心房組織200 mg，1 mL Triol，0.2 mL氯仿，室溫振蕩離心，吸取上層液，分別加入異丙醇、75%乙醇振蕩離心棄上清液，DEPC沉淀，-80 ℃凍存。逆轉錄合成cDNA:反應體系[10×RT buffer 1 μL，MgCl22 μL，Taq mix DNA polymerase 3 μL，RNase Free雙蒸超純水4 μL，dNTP Mixture (10 mm/mol) 1 μL，RNase抑制劑0.3 μL，Random Premiers 0.5 μL]混勻快速離心1次。PCR反應：RT產物5 μL加入dd H2O至總體積25 μL。反應條件：94 ℃ 2 min，1個循環；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min，1個循環。PCR產物-20 ℃凍存。取產物10 μL，Buffer 2 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統分析，測定目的片段與β-actin吸光度比值。引物序列見表1。

表1 引物序列

-:此項無數據

A:CHD-SR組；B:RHD-SR組;C:RHD-pAF組;D:RHD-cAF組

圖1各組心房肌組織結構變化(HE×400)

A:CHD-SR組；B:RHD-SR組;C:RHD-pAF組;D:RHD-cAF組

圖2各組心房肌CVF比較(苦味酸天狼猩紅染色×100)

2 結 果

2.1臨床資料分析 RHD-cAF組患者左心房內徑(LAd)明顯大于RHD-SR組，差異有統計學意義 (Plt;0.05)。年齡、性別、左室射血分數(LVEF)等在各組間差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表2。

表2 各組患者的臨床資料比較

a：Plt;0.05，與RHD-SR組比較

2.2組織病理學檢查 普通光鏡下，HE染色顯示在CHD-SR組、RHD-SR組、RHD-pAF組、RHD-cAF組，心肌細胞周圍間質纖維化逐漸增多，心肌細胞數量逐漸減少，大小逐漸增粗，排列紊亂程度逐漸加重，見圖1。

表3 各組心房肌CVF比較

a：Plt;0.05，與CHD-SR組比較

表4 各組心房肌TGF-β1的表達

a：Plt;0.05，與CHD-SR組比較

2.3各組心房肌CVF比較 苦味酸天狼猩紅染色提示膠原分布于心肌間質中。Ⅰ、Ⅲ型CVF及其比值在CHD-SR組、RHD-SR組、RHD-pAF組和RHD-cAF組逐漸升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)，見表3、圖2。

2.4各組TGF-β1的表達比較 TGF-β1蛋白和mRNA的表達在CHD-SR組、RHD-SR組、RHD-pAF組和RHD-cAF逐漸增加，見表4，圖3、4。

圖3 各組心肌組織中TGF-β1 蛋白表達

M:marker;1:RHD-cAF組；2:RHD-pAF組；3:RHD-SR組；4:CHD-SR組

圖4各組心肌組織中TGF-β1mRNA表達

3 討 論

房顫是心血管領域重大難題之一，探索其有效的治療手段是該領域熱門課題，這一問題關鍵在于對房顫發生機制的明確。1997年法國科學家Haissaguerre提出肺靜脈肌袖電位是房顫驅動和觸發因素，并提出環肺靜脈電隔離可終止房顫。近20年，國內外心臟電生理學者對房顫觸發、維持機制及其臨床問題的研究已形成熱點。房顫發生與維持機制存在多子波折返學說、心房離子通道電學重構學說及心房組織結構重構學說。近年大量研究關注心房組織的結構重構，許多研究提示結構重構在房顫發生與維持機制的作用大于電學重構[3-4]。

TGF-β是一類多功能的細胞因子，在結構上存在3種不同的亞型(TGF-β1、β2和β3)，其中TGF-β1生物學功能最重要，TGF-β1介導的細胞內Smads信號轉導通路與組織結構纖維化密切相關[5]。動物實驗表明，如果誘導結構正常心臟TGF-β1過度表達也可導致心肌組織纖維化。

本研究發現，房顫組心肌間質纖維化明顯增加，心房細胞異常增大增粗且斷裂，大小不均、排列紊亂、細胞核增大。進一步研究發現，Ⅰ型和Ⅲ型CVF及其比值較竇性心律組明顯升高，提示房顫組心房肌成纖維細胞增殖活躍，膠原蛋白合成與分泌增加。心房組織纖維化過程既是心房損傷修復過程，也是心房組織適應新的生理病理狀態的調節過程，這一過程涉及心房成纖維細胞和肌成纖維細胞肥大增生，合成分泌纖維網狀膠原增加。國外大量研究也表明，心房組織纖維化是心房結構重構的重要機制[6-8]，本研究結果與國外報道一致。

既往國內外研究發現，TGF-β1細胞內信號轉導與心房組織纖維化重構密切相關[9-11]。TGF-β1能誘導人心房成纖維細胞Ⅰ型膠原表達增加，動物實驗發現，TGF-β1高表達導致小鼠心房間質纖維化加重。細胞實驗發現，TGF-β1誘導心房成纖維細胞Ⅰ型膠原表達增加，同時使P-Smad2、Smad4 mRNA和蛋白水平表達增加。本研究發現，TGF-β1無論在蛋白質翻譯和基因轉錄水平的表達在RHD-pAF組明顯增加，在RHD-cAF組更為顯著。

本研究提示，風心病房顫發生機制與心房組織纖維化重構密切相關，Ⅰ型/Ⅲ型膠原網絡重構在這一過程中發揮重要作用。綜合國內外研究發現， TGF-β1過度表達可能是心房組織纖維化網絡重構的分子機制之一，但TGF-β1通過何種信號轉導途徑或如何介導心房間質纖維化的具體分子機制有待進一步基礎與臨床研究。

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StudyonthecorrelationbetweenatrialfibrosisremodelingandTGF-β1expressioninpatientswithrheumaticheart*

XiaoXiangbin1，LiuLi1，LiuTingting1，LiKui1，LeiKaijian2，ChangGuanglei3

(1.DepartmentofCardiology,theSecondPeople′sHospitalofYibinCity,Yibin,Sichuan644000,China；2.CancerMolecularMedicineLaboratory,theSecondPeople′sHospitalofYibin,Yibin,Sichuan644000,China；3.DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the remodeling of atrial fibrosis in rheumatic heart disease (RHD) patients with atrial fibrillation and its possible mechanism.MethodsThe clinical data and right atrial tissue specimens were obtained from patients who had undergone mitral valve replacement for rheumatic valvular disease or who had undergone thoracotomy for congenital heart disease in the Second People′s Hospital of Yibin from Oct.2013 to Oct.2015.According to the heart rhythm characteristics,the specimens obtained from these patients were divided into sinus rhythm group (RHD-SR group,18 cases),paroxysmal atrial fibrillation group (RHD-pAF group,21 cases) and persistent atrial fibrillation group (RHD-cAF group,42 cases).The right atrial tissue specimens obtained from those who had undergone thoracotomy for congenital heart disease with sinus rhythm were taken as the control group(CHD-SR group,21 cases).The structures of atrial tissues were observed under a light microscope.The picric acid-sirius red staining was used to detect collagen volume fraction (CVF) of type Ⅰand Ⅲ collagen and the type Ⅰ/Ⅲcollagen CVF ratio.The expressions of TGF-β1protein and mRNA were detected by using Western blot and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe left atrial diameter (LAd) in the RHD-cAF group was significantly higher than that in the RHD-SR group (Plt;0.05),but no statistically significant difference was found in other clinical data among these groups (Pgt;0.05).The results of picric acid-sirius red staining demonstrated that the volume fraction of type Ⅰ and type Ⅲ collagen and the ratio of typeⅠ/Ⅲ collagen were increased in CHD-SR group,RHD-SR group,RHD-pAF group and RHD-cAF group,gradually,there were statistically significant differences (Plt;0.05).The expression levels of TGF-β1protein and mRNA were increased gradually in CHD-SR,RHD-SR,RHD-pAF and RHD-cAF groups (Plt;0.05).ConclusionAtrial fibrosis remodeling is an important mechanism of atrial fibrillation in patients with RHD.High expression of TGF-β1may be involved in the remodeling of atrial fibrosis.

rheumatic heart disease;atrial fibrillation;fibrosis remodeling;transforming growth factor beta 1

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.019

宜賓市自然科學基金資助項目(2013SF013)。

肖祥彬(1973-),副主任醫師,博士,主要從事心律失常方面的研究。

R541.7+5

A

1671-8348(2017)32-4529-04

2017-04-28

2017-07-16)