精液處理前、后精子3項對IVT-ET結局的相關性分析

陳紹威，王明勇，付 莉，黃桂英，王 芳，劉 霜，毛熙光

(1.西南醫科大學附屬醫院生殖醫學技術部，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學第一附屬醫院婦產科，四川瀘州 646000)

·論著·臨床研究

精液處理前、后精子3項對IVT-ET結局的相關性分析

陳紹威1，王明勇1，付 莉1，黃桂英1，王 芳1，劉 霜1，毛熙光2

(1.西南醫科大學附屬醫院生殖醫學技術部，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學第一附屬醫院婦產科，四川瀘州 646000)

目的探討精液處理前、后精子3項對體外受精-胚胎移植(IVT-ET)結局的相關性。方法回顧性統計分析西南醫科大學附屬醫院298例行IVT-ET治療的男方精液，按照WHO標準對處理前精液進行常規分析，Vitrolife密度梯度離心結合上游法處理精子后分析記錄精液各項參數，受精并進行序貫培養至第3天觀察統計。結果精液處理前后精子總活力、正常形態精子百分率、精子密度等差異有統計學意義(Plt;0.05)；處理后精子正常形態率與受精率、卵裂率呈正相關(r=0.487、0.250，Plt;0.05)；處理后精子總活力與受精率、卵裂率呈正相關(r=0.249、0.272，Plt;0.05)；處理后精子密度與2原核(PN)、多PN受精率呈正相關(r=0.609、0.243，Plt;0.05)。結論根據取卵當日處理后的精子參數對選擇合適的受精方式更有預測價值。

輔助生殖技術；精子參數；IVF結局；相關系數

精液常規分析一直以來都是輔助生殖技術(ART)領域評估男性生育能力的重要方法之一，也是男性不育癥疾病診斷、結局預測的主要依據[1]。在體外受精-胚胎移植(IVT-ET)前對精子的各類參數進行恰當的評估并選擇合適的受精方式，對受精具有重要影響。而在臨床中根據處理前常規精液分析結果對患者進行IVF或者ICSI治療方案[2-3]；許多研究中所采用數據也是采用處理前精液常規分析結果進行研究[4]。但在實施ART的過程中，真正用來進行體外受精的精子是經過優化處理后的精子，而非優化處理前的精子，經過優化處理前、后精液的各項參數不盡相同[5-7]。因此，本研究回顧性分析了西南醫科大學附屬醫院298例病例，對精液處理前、后精子總活力、正常形態百分率和精子密度3項指標與IVF結局進行相關性分析，旨在深入探討優化處理前、后精子各項參數結果對IVF結局的影響，從而選擇最佳檢測結果作為判斷標準，對單純輸卵管因素不孕夫婦實施輔助生殖治療時采用何種輔助助孕方法提供臨床指導。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014-2015年在該院生殖中心擬行IVT-ET治療的夫婦，共298對。所有對象均滿足以下條件：女方各基礎指標正常，因單純雙側輸卵管堵塞性因素不孕；年齡23～43歲，平均為(30.07±4.48)歲；不孕年限大于或等于1年；獲取卵數大于或等于4枚；無卵巢手術史；無遺傳家族病史；均為標準長方案刺激周期取卵。男方年齡24～46歲，平均為(32.43±3.95)歲；無外傷；無遺傳性疾病家族史及無功能障礙病史；體檢未發現有明顯睪丸、附睪及輸精管異常；禁欲3～7 d，于配偶取卵當日進行手淫法采集新鮮精液，精液常規檢測基本正常。雙方染色體檢查均未見異常，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1精液采集 標本均在禁欲3～7 d后于女方取卵手術當天，手淫法取全部精液于無菌容器中，注明標本編號及患者姓名，記錄禁欲天數和取精時刻，置于37 ℃恒溫箱內液化，并記錄液化時間。

1.2.2精液常規分析 待精液完全液化后，混勻精液，記錄液化時間、精液量、顏色等。每份標本隨機采樣至少200個精子以上，采用計算機輔助精液圖像分析系統進行分析。取5 μL精液滴加于精子標準計數板，進行精液常規和運動參數分析，常規方法制備精子形態涂片，采用Diff-Quik方法進行染色，參照第5版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》精子形態分析標準進行形態學評判，記錄統計：精子正常形態率、精子總活力、密度、前向運動、非前向運動及IgG等參數。

1.2.3精子優選處理 采用密度梯度離心法分離精子，將充分液化混勻的精子加入已預熱的90%Sperm grad(Vitrolife，瑞典)進行梯度離心，吸取沉淀，轉移到含有1.5 mL的G-IVF中，離心，棄掉上清液；然后再加入1.5 mL的G-IVF，進行離心，棄掉上清液，將精子沉淀轉移至含有0.5 mL的G-IVF的離心管底部，置于6%CO2、5%O2、95%濕度、溫度為37 ℃的培養箱培養30 min，吸取上清液進行體外受精。取受精后剩下的上清液再次進行精液常規分析，記錄統計：精子正常形態率、精子總活力、密度、前向運動、非前向運動及IgG等參數。

1.2.4超促排卵 均采用該中心的常規標準長方案進行超促排卵，前次月經周期第21天，開始使用促性腺激素釋放激素(GnRH-a)，月經第3天肌內注射果納芬(Gonal-F，Gn)，當有3個以上卵泡直徑大于或等于18 mm，血黃體生成素(LH)lt;5 U/L，黃體酮(P)lt;16 nmol/L時停止使用促性腺激素Gn，給予人絨毛膜促性腺激素(hCG，Serono，瑞士)，36 h后陰道B超引導取卵。

1.2.5體外受精與胚胎培養 精子獲能30 min，取卵后將卵子放在G-IVFTMPLUS培養液中成熟2 h后進行體外授精，置于水套式三氣培養箱(37 ℃、6%CO2、5%O2、95%濕度)中培養，體外受精后5 h拆蛋觀察第二極體出現情況并判定受精狀態。根據Garden評分系統對d0、d1、d2、d3時間段分別記錄2極體(Pb)、2原核(PN)或多PN受精率、卵裂率、優質胚胎率等。本研究2PN受精率=2PN受精數/獲卵總數×100%；多PN受精率=多PN受精率/獲卵總數×100%；卵裂率=受精卵裂胚胎數/受精數×100%；優質胚胎率=3～4級/受精數×100%。

2 結 果

2.1處理前、后精子總活力、正常形態、總密度等相關性 處理后精子總活力高于處理前，且處理前后呈正相關(r=0.29，Plt;0.01)；處理后精子正常形態率高于處理前，且處理前后呈正相關(r=0.25，Plt;0.05)；處理后精子密度低于處理前，且處理前后呈正相關(r=0.26，Plt;0.05)，見表1。

表1 298例患者精液處理的臨床資料

2.2IVF結局 共獲卵4 518枚，進行體外受精后平均2PN受精率、多PN受精率、卵裂率、優質胚胎率分別為(68.08±16.23)、(14.62±10.25)、(85.75±14.89)、(60.43±22.87)%。

2.3處理前、后精子總活力、正常形態、總密度與IVF結局相關分析 處理前精子正常形態率與IVF結局4項(平均2PN受精率、多PN受精率、卵裂率、優質胚胎率)無相關性(Pgt;0.05)，處理后精子正常形態率與受精率呈正相關(r=0.487，Plt;0.01)，與卵裂率正相關(r=0.250，Plt;0.05)；處理后精子總活力與受精率呈正相關(r=0.249，Plt;0.05)，與卵裂率呈正相關(r=0.272，Plt;0.05)；處理前精子密度與IVF結局4項相關不顯著，處理后精子密度與2PN受精率呈正相關(r=0.609，Plt;0.01)，與多PN受精率呈正相關(r=0.243，Plt;0.05)，見表2。

表2 精液處理前后對IVF結局相關性分析(r,P)

3 討 論

臨床選擇受精方式依據診斷當日所獲精液常規分析結果決定受精方式，而非依據取卵當日處理后的精液。有研究證實精液經過處理后，各項精液參數百分比都優于處理前的參數，能顯著提高精子的質量[5-7]。另外，常規精液檢測只包括：精液量、精子密度、精子活率、酸堿度、顏色等，其對精子功能的檢測有限。眾多研究表明，精子形態、DNA完整性、頂體酶活性等精子功能對IVF受精率、卵裂率、臨床妊娠率、流產率等有關[8-10]。但以上研究用的是處理前的精液，存在較多的死精子及雜質，且檢測方法不統一，得出的結果有差異，無法正確地反映精子的功能。在實施ART的過程中，真正用來進行體外授精的是經過優化處理后的精子，而非處理前的精子。因此處理前的精液參數不能準確反映體外受精結局。為了更好控制試驗條件，本研究選擇了因單純性輸卵管堵塞造成的不孕，并取卵4枚以上，盡可能減少女方不孕因素影響。鑒于此，本研究對精液處理前、后精子參數與IVF結局的相關性進行比較，探討可靠的臨床指導標準。

本研究結果顯示，處理前精子正常形態率與IVF各項結局相關性不顯著，但處理后精子正常形態率與受精率和卵裂率呈正相關。有研究顯示正常形態率與受精率有相關性[11-12]，而也有相關研究顯示精子正常形態百分率與其受精率無直接相關性，對預測IVF結局的價值有限[13-14]，因此精子正常形態率在預測受精率方面一直存在很多爭議。也許造成爭議可能是由于形態標準、染色方法、研究對象等不同導致。但是經查證，以上研究中所用數據均是處理前的數據，而在優化處理過程改變了精子的各項參數，導致處理前、后精液基本參數差異顯著。因此使用處理前數據對IVF結局分析將存在極大波動性，從而出現了精子正常形態率能否預測受精率的爭議。精子的受精能力首先取決于與透明帶上糖基結合的能力，當精子的形態發生改變時，將影響到精子表面的結構，從而影響精子固著透明帶的能力，因此降低了受精率[15]。另外，精子正常形態與功能密切相關，頭部畸形的精子運動速度減慢，頭部頂體異常可能缺乏細胞表達蛋白，不具備與透明帶結合的能力，使精子失去受精功能。本研究發現處理前精子正常形態率與受精率相關性不顯著，而處理后正常形態率與受精率呈正相關，提示處理后的精子正常形態率更能預測IVF的受精率。同時精子正常形態率與卵裂率顯著正相關，而精子的形態不能反映其染色體是否異常，雖然能正常受精卵裂，但是不能影響卵裂后期胚胎發育。有研究得出同樣結論精子形態正常率對卵裂率有顯著影響，對胚胎發育及胚胎形態無明顯相關[16]。說明處理后精子正常形態率對受精率和卵裂率具有一定的預測作用。

本研究還發現，處理前精子活力與各項IVF結局相關性不顯著，處理后精子活力對受精率及卵裂率呈正相關。而影響精子活力的因素很多，如頂體形態、精子形態、精液中微量元素的水平、抗精子抗體等，在處理過程中，將畸形、異常、死亡的精子除去后，剩下活力較強的精子進行體外授精[17]。本研究結果顯示處理前后精子活力差異顯著，有報道稱精子的活力與精子核成熟、核形態都有相關性，因為形態正常有活力的精子通常都具有較為成熟的精子核，能正常完成卵裂[18]。另外Sivanarayana等[19]研究也發現精子活力與DNA完整性有關，細胞核正常意味著在一定程度上保證受精后具有良好后期發育。Luco等[4]研究發現精液處理前精子活力與IUI不相關，而精液處理后精子活力與IUI相關性顯著。對納入本研究的夫婦進行調查結果顯示未見畸形胎兒出生，根據本研究處理后精子活力對受精率及卵裂率具有顯著相關性的結果，意味著處理后精子活力對受精率及卵裂率具有預測作用。

本研究結果顯示精液處理前精液密度對IVF結局相關性不顯著，而處理后精液密度對2PN率具有相關性，對多PN也具有相關性。處理前后的密度差異顯著，正常的精子密度能夠保證精卵結合、頂體發生等受精過程。而處理前的精液含有一部分死亡或者畸形的精子，因此處理前的精子密度對IVF結局相關性不大。有研究表明無論是體內還是體外，隨著精子密度的升高，多PN受精率也會隨之提高[19]。Palomo等[20]報道了，山羊的多PN受精率與體外受精時不同精子密度相關。本研究結果顯示處理后精子密度對多精受精率有相關性，說明精子密度在一定程度上會影響精卵異常結合。精子數量的增多會延遲卵母細胞皮質顆粒的釋放，導致高頻的多精受精。處理后的精液密度與2PN率和多PN率顯著相關，進一步提示研究者依據處理后的精液密度加入合適的精液量。

綜上所述，精液處理前各項參數對IVF結局無相關性，而處理后精子的各項參數與IVF結局有相關性，即精液處理后的正常形態率和精子活力對IVF受精率和卵裂率更具有評估價值，對選擇合適的受精方式具有更重要指導意義，并依據處理后的精液密度加入合適的精液量，提高正常受精率。因此本課題組將會繼續研究優化處理后精液各項參數與IVF結局的關系，深入探究優化處理后精液參數對IVF結局的影響，為臨床提供更真實可靠的指導意義。

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CorrelativeanalysisofthreespermindexesandIVT-EToutcomeaftersementreatment*

ChenShaowei1,WangMingyong1,FuLi1,HuangGuiYing1,WangFang1,LiuShuang1,MaoXiguang2

(1.DepartmentofReproductiveMedicine,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between three sperm indexes and the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer(IVT-ET) before and after semen treatment.MethodsThe semen derived from 298 male patients treated with IVT-ET from the Affiliated Hospital of Southwest Medical University was retrospectively analyzed.Routine analysis of semen before treatment was performed according to the WHO standard.Vitrolife density gradient centrifugation combined with upstream method was used to analyze sperm parameters after sperm analysis,and the observation and statistics were performed after fertilization and sequential culture to day 3.ResultsThe total viability of spermatozoa before and after semen treatment,the percentage of normal spermatozoa,sperm density,and other differences were statistically significant(Plt;0.05);The normal sperm morphology rate was positively correlated with fertilization rate(r=0.487,Plt;0.01) and cleavage rate(r=0.250,Plt;0.05);The sperm vitality of post-processed semen was positively related to the fertilization rate(r=0.249,Plt;0.05,);and significantly cleavage rate(r=0.272,Plt;0.05);After treatment,sperm density was positively correlated with 2 PN(r=0.609,Plt;0.01) and multiple PN fertilization rates(r=0.243,Plt;0.05).ConclusionOur experimental results indicate that the parameters of post-processed sperm treated at the day when the oocytes were collected may be more helpful in predicting the fertilization rate and cleavage rate of IVF-ET.Therefore,the IVF-ET treatment protocols should be chose based on the normal sperm morphology rate and sperm vitality after semen treatment.

assisted reproductive technology;sperm parameter;IVF outcome;correlation coefficient

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.018

西南醫科大學科研基金(20130459)；西南醫科大學附屬醫院科研基金(11190)。

陳紹威(1981-)，助理研究員，碩士，主要從事輔助生殖方面的研究。

R394-33

A

1671-8348(2017)32-4526-03

2017-04-09

2017-06-13)