PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

馬 濤，邢宏運(yùn)△，卞鐵榮，李曉明，陳 燕，黃 娟

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000；2 西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

·論著·臨床研究

PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

馬 濤1，邢宏運(yùn)1△，卞鐵榮2，李曉明1，陳 燕1，黃 娟3

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000；2 西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

目的探討PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(ENKTCL-N)中的發(fā)病機(jī)制。方法通過(guò)免疫組織化學(xué)EnVision 法檢測(cè)PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在51例ENKTCL-N及20例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)患者中的表達(dá)。收集患者臨床資料，回顧性分析其臨床特征、療效及預(yù)后，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。結(jié)果PTEN 在ENKTCL-N患者中的陽(yáng)性率低于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)患者，p-AKT、p-4EBP1的陽(yáng)性率高于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；p-mTOR 在ENKTCL-N患者中的陽(yáng)性率高于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。PTEN陽(yáng)性患者生存率高于PTEN陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論P(yáng)TEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在ENKTCL-N中存在異常激活，可能與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)；PTEN陽(yáng)性患者預(yù)后可能較佳。

淋巴瘤，結(jié)外NK/T細(xì)胞，鼻型；mTOR信號(hào)通路；發(fā)病機(jī)制；預(yù)后

結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma,nasal type，ENKTCL-N)的發(fā)病率低，主要累及鼻腔、扁桃體、上顎、皮膚等結(jié)外器官，在歐美國(guó)家少見(jiàn)，而亞洲及拉丁美洲多見(jiàn)，尤以日本、中國(guó)多見(jiàn)[1]。早期臨床表現(xiàn)不典型，以壞死性病變?yōu)橹鳎哂懈叨惹忠u性，病程進(jìn)展快，生存期短，預(yù)后較差。目前ENKTCL-N精確的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，仍需要進(jìn)一步研究，對(duì)其有效的治療措施及預(yù)后的判斷標(biāo)準(zhǔn)也在不斷探討之中。PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路是一種Ser/Thr蛋白激酶，廣泛存在于惡性腫瘤中，控制著許多腫瘤相關(guān)的生物進(jìn)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、生存，蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控細(xì)胞周期及血管生成等，在胃癌、膀胱癌等多種腫瘤存在該通路的異常活化[2-3]。在淋巴瘤的研究表明，其與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)[4-5]。但其與ENKTCL-N的發(fā)病關(guān)系尚不明確，本試驗(yàn)擬探討PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在ENKTCL-N中的發(fā)病機(jī)制及PTEN基因?qū)NKTCL-N預(yù)后的影響，旨在為ENKTCL-N的研究及判斷ENKTCL-N的預(yù)后提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2010年6月至2015年3月確診的51例ENKTCL-N為觀察組，其中男36例，女15例；年齡21～82歲，gt;60歲者14例，≤60歲者37例，平均年齡50.76歲；發(fā)生于鼻腔者29例，其他部位22例；按照Ann Arbor分期，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例；無(wú)癥狀(A)者26例，出現(xiàn)無(wú)原因的發(fā)熱超過(guò)38 ℃，連續(xù)3 d以上，盜汗，6個(gè)月內(nèi)無(wú)原因的體質(zhì)量下降10%等癥狀(B)者25例；乳酸脫氫酶(LDH)升高者21例(LDHgt;245 U/L)，LDH正常者30例；根據(jù)IPI評(píng)分將其分為0～2分組26例，3～5分組25例。另收集反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標(biāo)本20例為對(duì)照組。

1.1.2主要試劑 兔抗人PTEN單克隆抗體、兔抗人p-4E-BP1單克隆抗體、兔抗人p-AKT單克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體購(gòu)自Bioworld technology，Envision試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法 PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR采用免疫組織化學(xué)EnVision 法，用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，已知陰性組織作為陰性對(duì)照，PBS代替一抗作為空白對(duì)照，免疫組織化學(xué)步驟按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2結(jié)果判斷 PTEN主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR主要表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕褐色表達(dá)，參照Fromowitz評(píng)分方法綜合細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度判定:無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定:lt;5%為0分,5%～25%為1分,gt;25%～50%為2分,gt;50%～75%為3分,gt;75%為4分;半定量綜合得分：兩項(xiàng)結(jié)果相加小于2分為陰性(-),2～3分為弱陽(yáng)性(+),4～5分為中度陽(yáng)性(++),6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.3隨訪 隨訪采用電話詢(xún)問(wèn)、患者住院病歷資料查閱等方式，隨訪時(shí)間為4年。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在觀察組及對(duì)照組中的免疫組織化學(xué)檢測(cè) PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR的表達(dá)主要集中在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀，在ENKTCL-N中著色比較均勻，而在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中著色分散。p-AKT在ENKTCL-N及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中的陽(yáng)性率分別為82.35%及25.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.11，Plt;0.05)；p-4EBP1在ENKTCL-N及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中的陽(yáng)性率分別為84.31%及35.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.77，Plt;0.05)；p-mTOR在及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中的陽(yáng)性率分別為60.78%及40.00%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.5，Pgt;0.05)，PTEN在ENKTCL-N及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中陽(yáng)性率分別為39.21%及85.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.06，Plt;0.05)，見(jiàn)表1、圖1～4。

表1 兩組患者中PTEN、p-AKT、p-4EBP1及p-mTOR的表達(dá)情況

2.2觀察組中PTEN的表達(dá)及與臨床參數(shù)關(guān)系 PTEN的表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀，在ENKTCL-N中散在分布，在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中分布均勻，見(jiàn)圖5。PTEN在ENKTCL-N中的表達(dá)率為39.21%。PTEN的表達(dá)率與患者年齡、性別、分組、體能評(píng)分、結(jié)外侵犯?jìng)€(gè)數(shù)、LDH及發(fā)病部位之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；在Ⅰ+Ⅱ期組與Ⅲ+Ⅳ期組PTEN陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.60，Plt;0.05)，在IPI評(píng)分為0～2分組與3～5分組之間PTEN陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.76，Plt;0.05),見(jiàn)表2。

A：×200；B：×400

圖1陰性對(duì)照的免疫組織化學(xué)表達(dá)

A：×200；B：×400

圖2 p-AKT在ENKTCL-N中的免疫組織化學(xué)表達(dá)

A：×200；B：×400

圖3 p-4EBP1在ENKTCL-N中的免疫組織化學(xué)表達(dá)

A：×200；B：×400

圖4 p-mTOR在ENKTCL-N中的免疫組織化學(xué)表達(dá)

圖5 PTEN的免疫組織化學(xué)表達(dá)

2.3PTEN陽(yáng)性者與PTEN陰性者生存情況 使用Kaplan-Meier法做生存曲線(圖6)，PTEN陰性及PTEN陽(yáng)性ENKTCL-N患者1年生存率分別為70.8%、87.8%,2年生存率分別為47.5%、80.2%。PTEN陰性患者生存率較PTEN陽(yáng)性患者低，PTEN陰性患者組中位生存時(shí)間為23個(gè)月，95%CI為17～28個(gè)月；PTEN陽(yáng)性患者組中位生存時(shí)間為31個(gè)月，95%CI為28～34個(gè)月。PTEN陰性患者與PTEN陽(yáng)性患者的生存時(shí)間行Log-Rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.204，Plt;0.05)。

表2 PTEN與ENKTCL-N臨床特征的關(guān)系

圖6 ENKTCL-N中PTEN陽(yáng)性與PTEN陰性患者生存曲線

3 討 論

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路廣泛存在于細(xì)胞中，其調(diào)控著細(xì)胞周期進(jìn)程蛋白質(zhì)的翻譯，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程及血管生成等多方面發(fā)揮重要作用。PTEN定位于10號(hào)染色體q23.3，是至今發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性的抑癌基因，是PI3K/AKT途徑的負(fù)向調(diào)控因子[6]。PTEN可抑制mTOR信號(hào)通路，而mTOR信號(hào)通路下游效應(yīng)分子P70S6K及4EBP-1啟動(dòng)后可促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯。PTEN的主要生物學(xué)功能為抑制細(xì)胞遷移及局部的黏附、抑制細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PTEN表達(dá)水平的降低、缺失及突變均可影響其功能[7-8]。

Xu等[4]對(duì)73例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在DLBCL中可能存在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化，p-AKT占54.8%,p-p70S6K占46.6%,p-4E-BP1占45.2%，存在mTOR信號(hào)通路激活的DLBCL患者病情進(jìn)展快，療效差。p-AKT在外周T細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)，達(dá)49%，且提示著預(yù)后較差[9]。Witzig等[10]在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中利用mTOR信號(hào)通路抑制劑治療35例套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，使用替西羅莫司每周250 mg，完全緩解率(CR)為3%，部分緩解率(PR)為35%，聯(lián)合利妥昔單抗治療緩解率達(dá)59%。Coiffier[11]在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中使用替西羅莫司每周175 mg，共3周治療MCL，OR為22%、CR為2%、PR為20%。以上研究均證實(shí)mTOR信號(hào)通路在淋巴瘤中存在活化。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在ENKTCL-N及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，ENKTCL-N患者p-AKT、p-4EBP1的表達(dá)率在觀察組中明顯增高，PTEN的表達(dá)率在觀察組中則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p-mTOR的表達(dá)率觀察組的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.5，Pgt;0.05)，考慮可能與樣本數(shù)量及實(shí)驗(yàn)室誤差相關(guān)；綜上結(jié)果，提示mTOR信號(hào)通路在ENKTCL-N中可能存在異常活化。

對(duì)患者臨床資料及PTEN基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、臨床分期、LDH水平無(wú)相關(guān)性，而PTEN陽(yáng)性多為Ann Arbor分期Ⅰ+Ⅱ期及IPI評(píng)分為0～2分患者，與PTEN陰性患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。生存分析顯示PTEN陽(yáng)性患者生存率較PTEN陰性患者明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，提示PTEN陽(yáng)性患者預(yù)后較佳。

高金莉等[12]采用相同研究方法，發(fā)現(xiàn)PTEN在ENKTCL-N中的陽(yáng)性率為32%，在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中的陽(yáng)性率為86.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究的結(jié)論基本一致。但其統(tǒng)計(jì)患者臨床資料發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、臨床分期、LDH水平均無(wú)相關(guān)性(Pgt;0.05)[12]，與本文的結(jié)果不完全一致，考慮原因?yàn)椋篜TEN的免疫組化檢測(cè)是客觀指標(biāo)，但患者一般資料與實(shí)驗(yàn)人員所選取的觀察組例數(shù)有密切關(guān)系，若進(jìn)行更大的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)可能會(huì)得出更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，本研究顯示PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在ENKTCL-N中存在異常激活，可能與其發(fā)病相關(guān)，可為靶向治療結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤提供新的靶點(diǎn)；PTEN陽(yáng)性患者預(yù)后較佳，生存時(shí)間較長(zhǎng)，PTEN陽(yáng)性可能為ENKTCL-N預(yù)后良好因素。

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ExpressionandsignificanceofPTEN/PI3K/AKT/mTORsignalingpathwayinextranodalNK/Tcelllymphoma*

MaTao1,XingHongyun1△,BianTierong2,LiXiaoming1,ChenYan1,HuangJuan3

(1.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.CenterLaboratoryofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investgate the pathogenesis of PTEN/PI3K/AKT/mTOR signaling pathways in nasal type extranodal NK/T cell lymphoma(ENKTCL-N).MethodsThe expression of PTEN,p-AKT,p-4EBP1 and p-mTOR in 51 patients with ENKTCL-N and 20 patients with reactive proliferative lymph nodes was detected by immunohistochemistry EnVision.The clinical data were collected and the clinical features,curative effect and prognosis were analyzed retrospectively.Survival analysis was performed by Kaplan-Meier method.ResultsThe positive rate of PTEN in ENKTCL-N patients was lower than that in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,and the positive rates of p-AKT and p-4EBP1 were higher than those in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,and the difference was statistically significant(Plt;0.05);The positive rate of p-mTOR in ENKTCL-N patients was higher than that in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,but the difference was not statistically significant(Pgt;0.05).The survival rate of PTEN-positive patients was higher than that of PTEN-negative patients,and the difference was statistically significant(Plt;0.05).ConclusionPTEN/PI3K/AKT/mTOR signaling pathway is abnormally active in ENKTCL-N,which may be related to its pathogenesis;PTEN-positive patients may have better prognosis.

lymphoma,extranodal NK-T-cell;nasal type;mTOR signaling pathway;pathogenesis;prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.014

四川省衛(wèi)生廳重點(diǎn)項(xiàng)目(110349)。

馬濤(1990-)，醫(yī)師，碩士，主要從事淋巴瘤、白血病診治研究。△

，E-mail:xinghy52003@foxmail.com。

R551.2

A

1671-8348(2017)32-4514-03

2017-04-26

2017-06-19)