左甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及機制探討

馮 佳,馬昌義,張艷珍

(1.四川省宜賓市第二人民醫院乳腺甲狀腺科 644000；2.西南醫科大學附屬醫院乳腺外科，四川瀘州 646000)

·論著·基礎研究

左甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及機制探討

馮 佳1,馬昌義1,張艷珍2

(1.四川省宜賓市第二人民醫院乳腺甲狀腺科 644000；2.西南醫科大學附屬醫院乳腺外科，四川瀘州 646000)

目的探討左甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及可能機制。方法SD 雄性大鼠60只，按隨機數字表分為A、B、C、D組，每組15只。其中B、C、D組大鼠均采取PLT制備甲狀腺功能減退模型，A組作為正常對照。造模成功后C組和D組大鼠每日分別腹腔注射左甲狀腺素(6 μg/100 g)，D組在C組的基礎上給予在飲用水中加入0.005%多奈哌齊。2周后，采用Morris水迷宮觀察大鼠學習記憶行為；用放射免疫法測定血清甲T3、T4 水平；采用免疫組織化學法和Western blot 法檢測各組大鼠海馬syntaxin-1 的表達情況。結果B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長，游泳速度明顯變慢；C 組和D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快；B組的T3、T4水平明顯降低。C組和D組的T3、T4水平明顯升高，其以D組升高最明顯。免疫組織化學法和Western blot法結果顯示B組大鼠海馬內syntaxin-1 表達水平低于對照組，C 組和D組大鼠海馬內syntaxin-1 表達水平明顯升高。結論左甲狀腺素聯合多奈哌齊可改善成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的學習和記憶能力，其機制與升高海馬組織syntaxin-1的表達有關。

左旋甲狀腺素；多奈哌齊；甲狀腺功能減退；突觸融合蛋白1；大鼠,Sprague-Dawley

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)，是指由多種因素引起甲狀腺激素合成、分泌或生物效應不足，表現為以甲狀腺功能減退為特點的臨床綜合征[1]。甲狀腺激素是三碘甲狀腺原氨酸(triidothyronine,T3)和四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)的總稱，是體內最大的內分泌腺甲狀腺所分泌的激素，在體內以游離或者與血清蛋白的形式存在。在人或動物生長發育的各個階段，都不能缺少甲狀腺激素。該激素在維持新陳代謝及腦神經系統的的正常發育方面扮演著重要的角色，且與認知功能密切相關。既往研究證實，甲狀腺激素缺乏能損害神經細胞，促進細胞凋亡，使神經系統發育明顯滯后，臨床以認知、行為、運動等腦的機能障礙為主要特征表現，顯微鏡下可見大腦及小腦的神經細胞數量減少[2]。突觸融合蛋白1(syntaxin-1)是分布于神經細胞突觸前膜上的蛋白，有文獻指出甲減導致的的認知功能障礙可能與海馬內的syntaxin-1水平失衡有一定相關性[3]。左甲狀腺素替代治療是對甲減患者的常規干預措施，然而對腦認知功能改善的程度的報道并不一致。大部分研究認為，常規劑量的左甲狀腺素替代治療并不能全恢復syntaxin-1水平[4]。一般大劑量的T4才能最大程度地恢復腦功能。值得注意的是，近年來，一種可治療阿爾茨海默病的藥物——多奈哌齊，受到眾多學者的關注。有研究認為，甲減與阿爾茨海默病發病機制相似：均為腦內乙酰膽堿(Ach)水平下降，多奈哌齊通過增加突觸間隙Ach水平，減輕甲減患者的認知損傷，或許可以用來作為甲減治療的輔助藥物。基于此，本研究以成年期甲減大鼠模型為研究對象，給予左甲狀腺素和多奈哌齊聯合治療進行干預，同時以常規劑量作為對照，通過檢測血清T3、T4水平及syntaxin-1在各組大鼠前額葉內的蛋白表達情況，探討左甲狀腺素聯合多奈哌齊治療是否可以恢復成年期甲減腦損傷及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠60只，體質量(245±30)g，購自上海市動物疫病預防控制中心。動物證號：SYXK(滬)2015-0013。

1.2主要儀器與試劑 病理切片機購自湖北泰康醫療設備有限公司；光學顯微鏡(蔡司LSM 510z)購自上海信裕生物科技有限公司；電子天平購自德國賽多利斯公司；放射免疫 γ 計數器(GC-300 型) 購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；形態學圖像分析軟件(JD-801)購自江蘇捷達科技發展有限公司。丙基硫氧嘧啶(PTU)購自上海博研生物科技有限公司；左旋甲狀腺素(LT4)購自天津赫索制藥有限公司；多奈哌齊片購自重慶植恩藥業有限公司；4%多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛購自北京索萊寶科技有限公司；T3、T4 放射免疫試劑盒購自北京原子高科核技術應用股份有限公司；兔抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體購自Sigma 公司；生物素標記兔抗小鼠lgG S-P 超敏試劑盒購自上海樊克生物科技有限公司；DAB 染色試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司。EPS-300 電泳儀、VE-186 轉膜電槽購自北京原平皓生物技術有限公司。Morris 水迷宮系統購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組和干預方式 所有實驗動物適應性喂養3 d后。把符合實驗條件的SD大鼠按隨機數字表分為4組，給予不同干預方式。正常對照組(A組)：常規喂養，灌服等體積的生理鹽水。甲減組(B組)：每日腹腔注射丙硫氧嘧啶(PTU)1 mg/100 g，持續6周，建立成年期甲減大鼠模型。LT4替代組(C組)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)2周；LT4聯合多奈哌齊(D組)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)，再繼續喂養2周，同時在大黃每日飲用水中加入 0.005%多奈哌齊。

1.3.2行為學檢測 藥物干預 2周后對所有實驗對象大鼠行 Morris 水迷宮行為學測試，考查大鼠認知及記憶能力。盡量保持室內光線一致，并保證迷宮附近物品及空間線索不改變。重點觀察大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度的變化。

1.3.3標本制備

1.3.3.1血清制備 在進行行為學檢測后，于次日晨9：00-11：00完成大鼠的采血工作。給予 7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射，待麻醉顯效后暴露胸腔，采集腹主動脈血 (每只1.5 mL)，高速離心后，取上清液存放于-20℃冰箱保存備測。

1.3.3.2腦標本制備 取血結束后將所有實驗動物斷頭處死，迅速于冰上剝離腦組織，右腦置于 4%的多聚甲醛溶液中固定1周，行常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚6 μm，每只大鼠取5個包含前額葉的切片，置于4 ℃ 冰箱保存待做免疫組織化學檢測。左腦分離出海馬組織后存放于-80 ℃冰箱保存用于免疫印跡試驗(Western blot)。

1.3.3.3放射免疫法測定血清甲T3、T4水平 T3、T4 水平的檢測采用放射免疫法，測儀器為GC-300型放射免疫γ計數器，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。質控范圍見表1。

1.3.4采用超敏SP 法行免疫組化檢測 組織切片行SP法行免疫組化染色，以棕黃色為判定為陽性染色。在 200 倍視野下拍攝前額葉的各層(分子層、外顆粒層、外椎體細胞層、內顆粒層、內椎體細胞層)。再采用雙盲法用生物圖像分析系統進行定量分析，計算平均吸光度值(A)。

表1 T3和T4質控范圍(mmol/L)

1.3.5Western blot 采集大鼠海馬背側組織置于勻漿器中，加裂解液冰上勻漿，離心，提取突觸小體后，以BCA 法行蛋白定量分析。蛋白變性、電泳、轉膜(電流為300 mA，轉膜時間為60 min)，封閉。接下來用抗syntaxin-1 多克隆抗體，1∶2 500室溫孵育2 h。立即加入濃度為1∶160 000的兔抗山羊IgG室溫孵育1.5 h，棄二抗，PBS洗膜，在 X 線片暗盒內曝光，再用顯影液顯影。通過syntaxin-1 與內參GAPDH的條帶A值的比值來代表目標蛋白的水平。

2 結 果

2.1觀察大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度的變化 與A組相比，B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長(Plt;0.05)，游泳速度明顯變慢(Plt;0.05)；與B組相比，C、D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快(Plt;0.05)，C、D兩組間比較無明顯差異，與A組相比差異也無統計學意義，見表2。

表2 大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度變化

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較

2.2觀察大鼠血清T3、T4 水平的變化 與A組相比，B組的T3、T4水平明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)。與B組相比，C、D組的T3、T4水平明顯升高(Plt;0.05)，D組比C組升高更加明顯(Plt;0.05)，見表3。

表3 大鼠血清T3、T4 水平濃度的變化

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較；c：Plt;0.05，與C組比較

2.3免疫組化檢測 syntaxin-1廣泛分布于前額葉皮質各層的神經細胞膜，見圖1。A組：Ⅰ層可見棕褐色顆粒密集和Ⅱ層均可見棕黃色顆粒狀致密排列；Ⅲ層分為深、淺兩層，呈疏松排列的棕褐色錐體細胞及少量星形細胞；Ⅳ層可見大量排列緊密的棕褐色色星形細胞和微量錐體細胞；Ⅴ層大量棕黃色大錐體細胞和少量小星形細胞組成。B組：細胞的排列和分布于A組相似相似，但密度比A組小。對A組和B組大鼠額葉syntaxin-1的表達情況進行量化分析后發現：與A組比較，B組大鼠前額葉皮質Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層syntaxin-1免疫反應產物A值顯著降低(Plt;0.05)，見表4。syntaxin-1免疫反應產物在各組大鼠前額葉皮質Ⅲ層的表達見圖2，syntsxin-1在各自大鼠前額葉各層的A值比較見表5。

2.4Western blot 法檢測各組大鼠海馬syntaxin-1表達變化 A、B、C、D組大鼠海馬內syntaxin-1表達水平分別為0.527±0.098、0.267±0.085、0.578±0.092、0.628±0.087。B組syntaxin-1水平低于對照組，差異有統計學意義(Plt;0.05);C、D組syntaxin-1水平比B組明顯升高(Plt;0.05)，與A組比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)。D組syntaxin-1水平比C組高，但差異無統計學意義(Plt;0.05)。見圖3。

表4 A、B組大鼠前額葉皮質內syntaxin-1的A值比較

a：Plt;0.05，與A組比較

圖1 syntsxin-1在A組和B組大鼠前額葉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ層的表達情況的典型圖片(SP×200)

圖2 syntaxin-1免疫反應產物在各組大鼠前額葉皮質Ⅲ層的表達(SP×200)

組別Ⅰ層Ⅱ層Ⅲ層Ⅳ層Ⅴ層A組13.35±1.1711.23±0.8710.24±0.7810.89±0.7811.76±0.86B組8.68±0.57a7.57±0.39a7.57±0.67a6.87±0.36a7.24±0.54aC組10.95±0.89b10.71±0.87b9.34±1.18b9.37±0.59b9.89±1.22bD組11.87±1.76b11.12±0.83b9.89±1.09b10.37±0.64b10.89±0.79b

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較

圖3 各組大鼠海馬內syntaxin-1 表達水平

3 討 論

甲減是血清T3、T4水平下降的一種常見的內分泌疾病，各個年齡段均可發病[5]。既往研究證實，甲狀腺激素缺乏可導致新生大腦發生不可逆的損傷。即使及時補充了甲狀腺激素，兒童期語言能力、智商得分也低于正常孩子，上述現象表明甲狀腺激素與神經系統的發育相關[6]。

研究表明，甲狀腺激素調節大腦末端分化過程。甲減狀態下大腦發生明顯的變化，如大腦皮質和小腦浦肯野細胞的神經纖維的發育遲緩，數量減少[7]。成年甲減能導致不同程度認知功能及相關腦區的損害，此種損害通過給予左旋甲狀腺素(LT4)進行替代治療能得到一定程度的修復。至于甲減患者的認知功能是否能夠完全恢復存在爭議，甚至有觀點質疑左旋甲狀腺素常規劑量替代治療甲減的效果，因此亟待挖掘治療甲減的新藥，為甲減的治療提供新的思路。

在制備甲減模型的實驗動物中，大鼠應用最多[8-11]。因為大鼠的甲狀腺機能與腦部發育過程與人類的相似度最高，可模擬和重現人類甲減的自然病程，只不過造模所需時間更長，一般需要4～6周。本研究選擇SD雄性大為造模對象，是為排除雌激素對甲狀腺激素合成和分泌的影響，而且造模周期符合傳統造模周期。另外，在誘導甲減模型的化學藥物中，丙硫氧嘧啶(PTU)化學誘導法應用頻率最高其通過抑制甲狀腺激素的合成的關鍵酶過氧化物酶來發揮作用的[9]。PTU的給藥途徑可以是口服或注射，本研究對SD雄性大鼠采取持續腹腔注射PTU(1 mg/100 g)6周的方法進行造模，從表3可以看出，B組大鼠的T3、T4水平明顯低于A組，該結果提示大鼠甲減模型制備成功。

目前，在行為神經科學研究中，嚙齒類動物的學習與記憶能力的評估常選用是國際通用的水迷宮實驗[12]。本研究采用水迷宮實驗對各組大鼠的認知功能進行評估，結果發現，與A組相比，B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長、游泳速度明顯變慢。結果表明B組的學習和記憶能力呈下降趨勢。經過藥物干預后C、D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快，可見，如大部分報道所示，LT4具有改善腦功能，提高記憶能力的作用。本研究結果顯示，聯合組治療組效果更明顯，分析原因而且可能與單純使用LT4 比較，多奈哌齊的加入能夠更有效地恢復樹突棘數量增加TRs的結合率，從而發揮更大的生理效應。

值得注意的是，為從分子水平對LT4的治療甲減的可能機制進行探討，本研究以大鼠海馬突觸小體內syntaxin-1蛋白為切入點。 syntaxin-1 蛋白在中樞神經系統神經遞質釋放過程中起到重要的調節作用[13]。研究顯示甲減大鼠不同的組織部位syntaxin-1 表達水平不太統一，究其原因可能與不同組織對甲狀腺激素缺乏的反應性有差異有關[14]。本研究結果顯示，與正常對照組組比較，甲減組大鼠前額葉皮質Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層syntaxin-1的表達是明顯降低的，與該組T3、T4 水平下降是一致的。經過LT4和LT4聯合多奈哌齊治療后syntaxin-1 表達恢復至對照組水平，與此對應的血清LT4和LT3也恢復至對照組水平。且記憶和學習能力等行為學指標也有改善。該結果提示：甲狀腺激素和多奈哌齊對 syntaxin-1 蛋白表達呈正性調節，甲狀腺激素替代治療使其恢復行為學的異常。然而，與單純甲狀腺激素替代治療相比，LT4聯合多奈哌齊治療后syntaxin-1蛋白表達有恢復得更理想的趨勢，其光密度絕對值更接近正常對照組。分析原因可能與多奈哌齊的加入有關。多奈哌齊是第二代膽堿酯酶(AChE)抑制劑，通過抑制膽堿酯酶的活性減少ACh的水解，從而升高Ach水平。臨床上常用來治療阿爾茨海默病，該病的特點就是記憶的進行性衰退，是一種中樞退行性疾病，研究顯示，多奈哌齊可延緩阿爾茨海默病中海馬的萎縮進程，起保護神經的作用。有學者也嘗試單獨用多奈哌齊治療甲減動物獲得成功，然而，具體機制尚不明確。有學者指出與抑制AChE有關，但有些學者提出相反意見，因為其他一些具有抑制中樞AChE的藥物如新斯的明并不能起到保護神經的作用。 有的學者認為多奈哌齊可能通過激活海馬內神經營養素受體發揮神經保護作用[15]。

綜上所述，成年期甲減大鼠的學習和記憶能力是下降的，與海馬內syntaxin-1 表達水平減少有關，而甲狀腺素可以在一定程度上改善甲減大鼠的行為學指標，與上調syntaxin-1表達水平有關，尤以甲狀腺素聯合多奈哌齊為甚。然而，由于檢測指標的局限，尤以甲狀腺素聯合多奈哌齊是怎么保護神經的？究竟多大的聯合劑量才是保護神經的最佳劑量？本研究尚未探明，需設計更加周密而詳盡的方案繼續深入研究。

[1]Cortinhas Alves EA,Andrade RC,de Melo Amaral CE,et al.Evaluation of the tshr gene reveals polymorphisms associated with typical symptoms in primary congenital hypothyroidism[J].J Pediatr Endocrinol Metab,2016,29(1):71-76.

[2]Khan A,Harney JW,Zavacki AM,et al.Disrupted brain thyroid hormone homeostasis and altered thyroid hormone-dependent brain gene expression in autism spectrum disorders[J].J Physiol Pharmacol,2014,65(2):257-272.

[3]李保山,查小雪,朱德發,等.甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠海馬syntaxin-1的影響[J].安徽醫科大學學報,2015,50(10):1390-1393.

[4]鄭燕,寧丹,朱洋波,等.甲狀腺素對甲狀腺功能減退癥大鼠海馬syntaxin-1蛋白表達的影響[J].中華地方病學雜志,2012,31(2):162-166.

[5]Sánchez-Huerta K,Pacheco-Rosado J,Gilbert ME.Adult onset-hypothyroidism:alterations in hippocampal field potentials in the dentate gyrus are largely associated with anaesthesia-induced hypothermia[J].J Neuroendocrinol,2015,27(1):8-19.

[6]Willoughby KA,Mcandrews MP,Rovet JF.Effects of maternal hypothyroidism on offspring hippocampus and memory[J].Thyroid,2014,24(3):576-584.

[7]Singh S,Trivedi R,Singh K,et al.Diffusion tensor tractography in hypothyroidism and its correlation with memory function[J].J Neuroendocrinol,2014,26(11):825-833.

[8]Wang Y,Wang Y,Dong J,et al.Developmental hypothyroxinaemia and hypothyroidism limit dendritic growth of cerebellar Purkinje cells in rat offspring:involvement of microtubule-associated protein 2(MAP2) and stathmin[J].Neuropathol Appl Neurobiol,2014,40(4):398-415.

[9]Akmal A,Kung J.Propylthiouracil,and methimazole,and carbimazole-related hepatotoxicity[J].Expert Opin Drug Saf,2014,13(10):1-10.

[10]吳鵬飛,周細華.甲狀腺切除術后甲狀腺功能減退癥替代治療的研究[J].實用藥物與臨床,2015,18(11):1329-1331.

[11]Beydoun MA,Beydoun HA,Rostant OS,et al.Thyroid hormones are associated with longitudinal cognitive change in an urban adult population[J].Neurobiol Aging,2015,36(11):3056-3066.

[12]Li K,Liu JW,Zhu ZC,et al.DSTYK kinase domain ablation impaired the mice capabilities of learning and memory in water maze test[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(10):6486-6492.

[13]Kofuji T,Fujiwara T,Sanada M,et al.HPC-1/syntaxin 1A and syntaxin 1B play distinct roles in neuronal survival[J].J Neurochem,2014,130(4):514-525.

[14]Vardar G,Chang S,Arancillo M,et al.Distinct functions of syntaxin-1 in neuronal maintenance,synaptic vesicle docking,and fusion in mouse neurons[J].J Neurosci,2016,36(30):7911-7924.

[15]Rodrigues Sim?es MC,Dias Viegas FP,Moreira MS,et al.Donepezil:an important prototype to the design of new drug candidates for Alzheimer′s disease[J].Mini Rev Med Chem,2014,14(1):2-19.

Effectoflevothyroxinecombinedwithdonepezilhydrochlorideinadultratswithhypothyroidismanditsmechanism

FengJia1,MaChangyi1,ZhangYanzhen2

(1.DepartmentofBreastandThyroidSurgery,theSecondPeople′sHospitalofYibin,Yibin,Sichuan644000,China;2.DepartmentofBreastSurgery,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the effect and potential mechanism of levothyroxine combined with donepezil hydrochloride in adulthood hypothyroidism rats.MethodsA total of 60 male SD rats was divided by random number table into group A,group B,group C and group D,15 rats in each group.The rats in group B,group,C and group D were treated with PLT to prepare hypothyroidism model,and group A was used as the control group.After successful preparation of the model,rats in group C and group D were injected intraperitoneally with levothyroxine(6 g/100 g) every day,and then group D was given another 0.005% donepezil in drinking water.After 2 weeks,the learning and memory behavior of rats was observed by Morris water maze;the levels of serum T3 and T4 were measured by radioimmunoassay;the expression of syntaxin-1 in hippocampus was detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe escape latency and swimming distance of rats were prolonged significantly in group B but shorted significantly in group C and group D,and swimming speed was significantly slowed in group B but significantly strengthened in group C and group D;the levels of T3 and T4 were obviously decreased in group B but increased significantly in group C and group D,especially in group D.The results of immunohistochemistry and Western blot showed that the expression level of syntaxin-1 in hippocampus of rats was lower in group B compared to control group but increased significantly in both group C and group D.ConclusionLevothyroxine combined with donepezil hydrochloride can improve the learning and memory ability in adult rats with hypothyroidism,and its mechanism is related to the increase of expression of synaptotagmin-1 in hippocampus.

levothyroxine;donepezil hydrochloride;hypothyroidism;syntaxin-1;rats,Sprague-Dawley

馮佳(1980-)，主治醫生，本科，主要從事乳腺外科方面的研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.006

R581.2

A

1671-8348(2017)32-4484-04

2017-04-12

2017-06-13)