枸杞總黃酮提取物對2型糖尿病大鼠血管內皮細胞的保護作用

王 偉，尚 佳△，楚元奎

(1.巴彥淖爾市醫院,內蒙古巴彥淖爾 015000;2.寧夏醫科大學檢驗學院,銀川 750004)

·論著·基礎研究

枸杞總黃酮提取物對2型糖尿病大鼠血管內皮細胞的保護作用

王 偉1，尚 佳1△，楚元奎2

(1.巴彥淖爾市醫院,內蒙古巴彥淖爾 015000;2.寧夏醫科大學檢驗學院,銀川 750004)

目的研究枸杞總黃酮提取物(TFLB)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立的糖尿病(DM)大鼠損傷模型血管內皮細胞保護作用。方法采用STZ誘導建立DM大鼠損傷模型，實驗分為正常對照組、DM模型組和TFLB干預組(60、90、120 mg/mL)。正常對照組及DM模型組大鼠每天每只予以等量生理鹽水灌胃，干預組大鼠以不同濃度TFLB灌胃4周。灌胃滿4周后，采用ELISA法測定大鼠血清血管性血友病因子(vWF)、可溶性血栓調節蛋白(sTM)、可溶性血管內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)變化情況，摘取胸主動脈組織做HE染色，觀察TFLB對DM大鼠血管內皮的保護作用。結果TFLB干預后，與DM模型組相比較，下調了血管內皮功能相關因子vWF、sTM、sEPCR 的水平，差異有統計學意義(Plt;0.05，Plt;0.01)；隨著TFLB劑量的升高，干預組大鼠主動脈內膜增厚程度明顯減輕,山巒樣突起逐漸減少，外膜未見明顯損傷，血管形態排列趨于規整。結論TFLB可以改善高血糖對血管內皮細胞的損傷，調節血管損傷相關因子含量的改變，延緩DM并發癥的進展程度，起到保護心血管系統作用。

枸杞總黃酮;糖尿病,2型;血管內皮細胞

關于心腦血管高危案例發生率、致殘率、病死率的大量數據調查顯示,糖尿病(DM)在所有危險因素中的占比較高[1]，DM患者如果長時間血糖濃度控制不穩定，血管內皮細胞由于血糖濃度波動較大，進而誘導機體發生應激應機制[2]，導致血管內皮細胞損傷和逐步凋亡，若長期處于較高應激狀態會導致細胞信號通路和基因性狀發生突變，高血糖是動脈粥樣硬化(AS)發生的首要危險因素之一[3]。因此，研討怎樣調節和保護長期高血糖狀態下血管內皮細胞的功能，對評估糖尿病及其并發癥進程具有十分重要的意義。近年來黃酮類化合物作為天然產物發揮調節免疫功能、降血糖、降血脂、抗氧化等功能備受關注[4]。有關寧夏枸杞生物活性及指紋圖譜等大量研究表明，寧夏枸杞黃酮類化合物生物活性較廣[5]，具有抗腫瘤、抗氧化、對抗自由基、抗慢性凋亡等多重重要藥理作用[6-7]。多年前，寧夏地區專家已經證實了枸杞總黃酮在抗氧化方面的生物活性[8]，并正確運用正交優化實驗驗證了其最理想的分離提取方法。基于上述成熟條件，加強枸杞黃酮化合物在對抗細胞氧化應激損傷分子機制方面的研發，指導對心腦血管疾病的治療具有非常重要的啟發和補充。因此，本研究運用鏈脲佐菌素(STZ)建立關于2型糖尿病大鼠的病理模型，研究枸杞總黃酮提取物(TFLB)對其血管內皮細胞作用的分子機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1飼料與動物 常規飼料：麩皮 20%；玉米粉30%；豆類10%；酵母粉 2%；標準粉 25%；維生素、微量元素添加劑各0.5%；魚肝油1%；骨粉 10%；食用鹽 1%。Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠：80只，體質量440～550 g，6周齡，許可證號:SYXK(寧)2011-0001，由寧夏醫科大學動物中心提供；

1.2試劑與儀器 枸杞總黃酮提取物(枸杞來源：寧夏農業科學研究院，鑒定人：研究員陳淑華；總黃酮：濃度99.8 mg/mL)。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司; 大鼠可溶性血管內皮細胞蛋白C受體(sEPCR，批號:JYM0566Ra)、大鼠可溶性血栓調節蛋白(sTM，批號:JYM0936Ra)、大鼠血管性血友病因子(vWF，批號:JYM0304Ra)，武漢基因美生物科技有限公司采購; HE 染色相關試劑：寧夏醫科大學檢驗學院提供。光學顯微鏡(日本Olympus)；快速血糖儀(強生)及配套試紙條；酶標儀(Me2tertech)；電子顯微鏡(日立H-600)；切片機(瑞典LKB-V)；蠟塊包埋機、切割機(德國Leica)。

1.3方法

1.3.12型糖尿病大鼠模型建立 常規飼養達標后，隨機選擇10只大鼠作為正常對照組，其余70只大鼠進行造模，隔夜禁食不禁水12 h以上，一次性腹腔皮下注射60 mg/kg STZ;正常對照組大鼠在皮下(腹腔)注射同體積枸櫞酸鹽緩沖液。觀察72 h后，于大鼠尾靜脈處穿刺采血，用快速血糖儀測定空腹血糖值，葡萄糖(GLU)gt;11.1 mmol/L為DM大鼠造模成功標準 。

1.3.2實驗分組及TFLB干預階段 將成模DM大鼠分成4組：DM模型組、TFLB干預組(低、中、高)。對照組和DM模型組大鼠每天采用等體積的生理鹽水來灌胃；TFLB干預組(低、中、高)大鼠每天分別以 60、90、120 mg/kg總黃酮進行灌胃干預，干預實驗周期為4周。

1.3.3血清因子水平檢測 藥物干預滿4周實驗結束后，隔夜將大鼠禁食不禁水12 h，之后給予50 mg/kg苯巴比妥腹腔麻醉，自腹部剪開皮膚于大鼠腹主動脈分叉處向心端1～3 mm處穿刺取血，以酶聯免疫分析法測定(ELISA)法檢測血清中vWF、sTM、sEPCR 因子水平。

1.3.4制作主動脈HE染色切片 摘取各實驗組大鼠胸主動脈，放置于固定液濃度為10%的甲醛中浸泡，在常溫條件下短期保存，為HE染色病理切片做好相關準備。

2 結 果

2.12型糖尿病大鼠模型的成功建立及灌胃飼養情況 常規飼養達標后腹腔注射STZ,3 d后大鼠均出現多食、多飲、多尿癥狀，且伴隨精神狀態萎靡不振、動作反應緩慢遲鈍、體型消瘦，毛發枯黃、不潔、干澀等狀態。模型組與正常對照組大鼠空腹GLU測定值相比較，差異有統計學意義(Plt;0.01)，在尾靜脈處穿刺取血測得67只大鼠空腹GLU水平均大于11.1 mmol/L，其中血糖水平最低為15.8 mmol/L，最高達20.1 mmol/L，造模成功,達到2型糖尿病造模標準;造模過程沒有大鼠死亡，有3只血糖水平測定值小于11.1 mmol/L，未成模，棄之不用。在實驗階段正常對照組大鼠死亡2只，DM模型組大鼠死亡19只。

2.2TFLB 對 DM模型組大鼠GLU水平的調控及影響 DM模型組大鼠灌胃前、中、后GLU與正常對照組相比升高(Plt;0.01); TFLB高劑量組灌胃后GLU水平與DM模型組相比有一定意義的下降，提示在特定濃度下其對控制血糖水平有一定的效果(Plt;0.05)；低、中劑量組大鼠GLU水平，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，見表1。

2.3TFLB對DM大鼠sTM、sEPCR、 vWF檢測水平的影響 與正常對照組相比較，DM模型組sTM、sEPCR、vWF因子的生成量明顯上調(Plt;0.01)。其中TFLB低劑量組sTM、vWF水平與DM模型組相比差異無統計學意義(Pgt;0.05)，而sEPCR檢測水平較DM模型組相比較下調，差異有統計學意義(Plt;0.05)；TFLB高、中劑量組sTM、sEPCR、vWF因子檢測水平與DM模型組相比均下調(Plt;0.01)，見表2。

2.4TFLB干預后各實驗組主動脈做HE染色后的橫切面圖 各組HE染色結果見圖1。正常對照組大鼠，其主動脈壁內部結構完整，形態分布規則；外膜整潔光滑未見明顯異常；中層平滑肌細胞排列整齊、緊密、形態大小分布一致；血管內皮細胞分布均勻，光滑連續；DM模型組大鼠主動脈內膜可見有明顯損傷突起，增厚顯著并出現粥樣硬化病變；內膜下間隙明顯增大、彈性纖維形態增粗且排列順序散亂,散在區域可見泡沫細胞，部分區域可見斑塊；TFLB低、中劑量組大鼠主動脈內膜仍見明顯突起且明顯增厚,外膜損傷程度有所減輕，血管內皮細胞可見明顯增生,排列尚不規整,偶見散在泡沫細胞；TFLB高劑量組大鼠主動脈內膜可見輕度增厚,血管內皮細胞增生相對輕度、排列相對趨于規整，鏡下外膜未見顯著損傷。

表1 各組大鼠GLU水平比較

a：Plt;0.05，與正常對照組比較；b：Plt;0.05，與DM模型組比較

表2 各組大鼠血清sTM、sEPCR、vWF水平比較

a：Plt;0.05，與正常對照組比較；b：Plt;0.05與DM模型組比較

A：正常對照組；B：DM模型組；C：TFLB低劑量組；D：TFLB中劑量組；E：TFLB高劑量組

圖1各組主動脈HE染色橫切面圖(HE×100)

3 討 論

大量研究表明，DM并發癥累及器官較多，其中心腦血管病變是其早期主要并發癥之一[9]，且損傷程度相對較為顯著。血管內皮細胞可以分泌、合成多種細胞因子，具有吞噬異物、細菌、壞死和衰老組織的功能，同時還可以參與集體免疫活動及調節保護血管活性物質，在護保血管通透性起到十分重要的作用，是保證和維護血管功能正常的一道天然屏障。血糖控制不理想，可誘導機體產生氧化應激，內皮細胞膜被大量自由基氧化損傷，導致內皮細胞膜調節水平下降、功能異常、紊亂[10]，進而誘發機體大血管和微血管方面的病變[11]，引起全身多系統的代謝障礙，嚴重影響了糖尿病患者的生活質量。目前體內外實驗研究發現：sTM、sEPCR、vWF合成及分泌水平均與血管內皮細胞的功能狀態直接相關，以上3個因子水平的調節變化，可以間接地反映血管內皮細胞在外因誘導應激狀態下損傷的不同程度。sMT是存在于血管內皮細胞膜表面的一種糖蛋白，當不同外界因素誘發血管內皮細胞應激損傷時其合成量增多[12]；當損傷累及病變程度較重，大血管損傷的標志因子sEPCR合成量也顯著增加[13]，與此同時鑒定內皮細胞受損程度特異性標志因子vWF隨損傷程度的不同相對升高[14]。因此研討怎樣保護和調節血管內皮細胞的功能，對指導和治療心腦血管疾病有十分重要的現實意義。當前對于能夠保護心腦血管功能，抑制血管內皮細胞慢性凋亡藥物的研發已成為心腦血管疾病靶向治療的熱點[15]。

因此本實驗以TFLB為研究對象，結合STZ誘導建立DM大鼠損傷模型。結果提示TFLB對DM大鼠血管內皮細胞具有一定程度保護功效，對DM并發癥的發生、發展起到積極的預防保護作用；但總黃酮的成分很多，需后續進一步作深入的研究證實，為研究新型治療糖尿病疾病中藥材提供理論依據。

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Protectiveeffectoftotalflavonoidsoflyciumbarbarumonvascularendothelialcellsintype2diabeticrats*

WangWei1,ShangJia1△,ChuYuankui2

(1.BayannurHospital,Bayannur,InnerMongolia015000,China;2.SchoolofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoids of lycium barbarum(TFLB) on vascular endothelial cells in streptozotocin(STZ)-induced diabetic mellitus(DM) rats injury model.MethodsThe injury model of DM rats was induced by STZ,and the rats were divided into normal control group,DM model group and TFLB intervention group(60,90 and 120 mg/mL).Rats in the normal control group and the DM model group were given the same amount of intragastric administration of normal saline every day.The rats in the intervention group were treated with TFLB at different concentrations for 4 weeks.After filling the stomach for 4 weeks,the blood samples were taken from the chest cavity,and the changes of serum vWF,sTM and sEPCR were measured by ELISA.The tissue of the thoracic aorta was removed and stained by HE,and the protective effect of TFLB on the vascular endothelium in DM rats was observed.ResultsCompared with DM model group,the levels of vascular endothelial function related factors vWF,sTM and sEPCR were down-regulated in the TFLB intervention group,and the difference was statistically significant(Plt;0.05,Plt;0.01).In the TFLB intervention group,with the increase of TFLB dose,the intima thickening degree of the rats was significantly reduced; the formation of mountain-like protrusions was gradually decreased; the outer membrane showed no significant damage; the vascular morphology arrangement tended to be regular.ConclusionTFLB can improve the hyperglycemia-caused damage of vascular endothelial cells,regulate the content of vascular injury related factors,delay the progression of DM complications,and protect the cardiovascular system.

total flavonoids from lycium barbarum;diabetes,type 2;vascular endothelial cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.005

寧夏自然科學基金資助項目(NZ11116);氯化鋰對小鼠糖尿病動脈粥樣硬化防治作用的初步研究(XM2011008)。

王偉(1983-)，主管技師，碩士，主要從事臨床檢驗診斷學的研究。△

,E-mail：185362514@qq.com。

R285.5

A

1671-8348(2017)32-4481-03

2017-04-23

2017-06-27)