甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡、NSE及IL-6的影響

董菲菲，潘宇政△，彭玲玲，韋錦斌

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

·論著·基礎研究

甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡、NSE及IL-6的影響

董菲菲1，潘宇政1△，彭玲玲1，韋錦斌2

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

目的通過觀察甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡、血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)、白細胞介素(IL)-6的影響及血清FT3、FT4的改變，探討甲狀腺素對重型顱腦損傷腦組織的保護作用。方法90只SD大鼠分為對照組﹑模型組﹑左甲狀腺素鈉片低劑量組、左甲狀腺素鈉片中劑量組、左甲狀腺素鈉片高劑量組5組，每組各18只，參照Feeney′s自由落體打擊造模法復制動物模型；于傷后6 h灌胃。灌胃后24、72、168 h分別通過TUNEL法、ELISA法及放射免疫法檢測神經細胞凋亡、血清NSE、IL-6 及血清FT3、FT4水平。結果(1)重型顱腦損傷大鼠受傷后血清FT3、FT4水平低于正常水平，FT4在168 h降到最低，甲狀腺素可使FT3、FT4水平升高。(2)重型顱腦損傷大鼠受傷后出現明顯的神經細胞凋亡，這種凋亡持續至168 h。中劑量及高劑量甲狀腺素在24 h即可以改善神經細胞凋亡，低劑量甲狀腺素在168 h才可以改善神經細胞凋亡。(3)重型顱腦損傷大鼠血清NSE、IL-6于傷后明顯升高，一直持續到168 h。中劑量及高劑量甲狀腺素在72 h即可以降低血清NSE、IL-6水平。結論外源性甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠腦組織具有保護作用。

甲狀腺素；重型顱腦損傷；原位缺口末端標記；血清神經元特異性烯醇化酶；白細胞介素6

甲狀腺激素是胎兒、新生兒腦部發育的必需且關鍵的激素；在胚胎時期，甲狀腺激素能促進神經元增殖、分化、突觸和突起的形成，以及膠質細胞生長與髓鞘形成，并能誘導神經生長因子及某些酶的合成，還能促進神經元骨架的發育等；如果胎兒或新生兒甲狀腺功能低下,會導致以智力遲鈍和身材矮小為表現的呆小病；而甲狀腺激素升高可引起中樞神經系統的興奮性升高[1]。據此推測，甲狀腺素對顱腦損傷神經組織的修復和保護可能有促進作用。然而，目前有關甲狀腺素對重型顱腦損傷腦組織修復和保護影響的報道還很少見。為此筆者通過神經細胞凋亡、血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)、白細胞介素(IL)-6等指標，觀察甲狀腺素對重型顱腦損傷腦組織的保護作用。

1 材料與方法

1．1材料與試劑 SPF級雄性SD大鼠90只，體質量(230±20)g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，許可證號:SCXK(桂)2014-0002。左甲狀腺素鈉片購于廣西醫科大學第一附屬醫院西藥房(德國生產，進口藥品注冊證號：H20140052)；TUNEL(Situ cell death detection kit，pod)試劑盒購于Roche 公司；大鼠NSE檢測用武漢華美公司的ELISA 試劑盒，編號:CSB-E07963r；大鼠IL-6用欣博盛生物科技有限公司的ELISA試劑盒檢測，編號:ERC003；FT3、FT4在廣西醫科大學第一附屬醫院核醫學科實驗室完成。

1．2儀器與設備 改良的Feeney′s 自由落體打擊裝置；Multiskan FC 酶標儀(塞默飛世爾儀器有限公司生產)；高速冷凍離心機(英國生產，型號：英泰TDL5M)；正置熒光相差顯微成像鏡(型號：BX53+DP73+cellsens)。

1.3方法

1.3.1動物分組及給藥 SD大鼠分成對照組、模型組、左甲狀腺素鈉片低劑量組、左甲狀腺素鈉片中劑量組、左甲狀腺素鈉片高劑量組5組，每組各18只。給藥組在造模后6 h予左甲狀腺素鈉片灌胃，低、中、高劑量分別為每只大鼠0.65、1.00、1.54 μg/100 g，劑量計算方法依據徐淑云藥理實驗方法學公式計算[中劑量=(人的用量×換算系數0.018×3.16倍)/2，低劑量是中劑量的0.65倍，中劑量是高劑量的0.65倍]，對照組與模型組分別在傷后6 h以等量生理鹽水灌胃，每組每天灌1次，接連7 d。

1.3.2重型顱腦損傷模型制備 參照Feeney′s 自由落體打擊造模法[2]。將大鼠稱重后，用濃度為10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)經腹腔注射麻醉，剪除大鼠頭部毛發并消毒，在矢狀正中處切開頭皮并將骨膜剝離，露出左側頂骨，在中線旁左側2.5 mm，冠狀縫后1.5 mm處，用迷你電鉆鉆1個小洞，并擴大至直徑約為5.0 mm的骨窗，保證硬腦膜的完整性；用一直徑約4.5 mm，厚度約3.5 mm的圓形鋼板墊放至硬膜外，將50 g擊錘至20 cm高處呈自由落體沿套管落下，打擊于圓形墊，導致大鼠頂葉局部性腦挫裂傷，打擊完后，用骨蠟封閉骨窗，再縫合頭皮。受傷動物醒后，放回原籠喂養，如出現死亡大鼠，則隨機用替補動物補上，保證每組每時間段有6只大鼠。造模后6 h后參照文獻[3]對每只大鼠行神經功能缺損評分，其評分標準參照《現代藥理實驗方法學》[4]，采用10 分制、單盲法進行評分，≥2 分表示造模成功，lt;2 分則剔除。

1.3.3標本采集 各組分別在造模后24、72、168 h 3個時間段取材，每個時間段每組隨機取6只大鼠。(1)于心臟采血4 mL，4 ℃，2 200 r/min 離心15 min，取上清液，置-80 ℃冰箱待測NSE、IL-6、FT3及FT4。(2)經升主動脈灌注250 mL的0.9%氯化鈉注射液，直至右心房流出清亮液為止，再予250 mL 4%多聚甲醛液灌注，斷頭取腦，并快速將腦浸入4%多聚甲醛液中，固定24 h后修成4 mm方塊，常規乙醇脫水，石蠟包埋，待測神經細胞凋亡。

1.3.4FT3、FT4檢測 用放射免疫法進行檢測，在廣西醫科大學第一附屬醫院核醫學科實驗室完成。

1.3.5神經細胞凋亡檢測 以TUNEL 原位法檢測損傷區凋亡細胞，嚴格按試劑盒說明步驟進行檢測。腦組織蠟塊行3 μm切片，切片65 ℃預熱，脫蠟(二甲苯與乙醇各洗4次)，水洗，加蛋白酶K于37 ℃孵30 min，PBS洗1次，于避光條件下加TUNEL混合液37 ℃溫育1 h后在顯微鏡下觀察，每組6只大鼠分別選同一冠狀層的切片，在高倍鏡下觀察，細胞核中出現棕黃色的為陽性細胞，在8個高倍視野中計數TUNEL 陽性標記細胞，陽性率=陽性細胞數/(陽性細胞數+ 陰性細胞數)×100%。

1.3.6血清NSE檢測 采用ELISA法檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行檢測。加樣并于37 ℃溫育，加生物素標記抗體工作液于37 ℃反應溫育，洗板后加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液于37 ℃反應，溫育洗板，加底物溶液于37 ℃避光顯色，加終止溶液終止反應，酶標儀450 nm波長依序測量各孔的濃度值。

1.3.7血清IL-6檢測 采用ELISA法檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行檢測。加樣并于36 ℃孵育，洗板，加生物素化抗體工作液于36 ℃孵育，洗板，加酶結合物工作液于36 ℃孵育，洗板，加顯色底物于36 ℃避光孵育，加終止溶液終止反應，酶標儀450 nm波長按順序測量各孔的濃度值。

2 結 果

2.1血清FT3、FT4水平 模型組FT3、FT4在24、72、168 h明顯低于對照組，各用藥組明顯高于模型組，差異有統計學意義(Plt;0.05)。模型組FT4在24 h及72 h時間段與168 h時間段比較有明顯差異。模型組FT3的各個時間段比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，見表1、表2。

表1 各組血清FT3水平比較

a：Plt;0.01，與模型組比較

表2 各組血清FT4水平比較

a：Plt;0.01，與模型組比較；b：Plt;0.01，與同組168 h時間段比較

2.2腦組織TUNEL細胞凋亡率 模型組及各用藥組與對照組比較，神經細胞凋亡率明顯升高，差異具有統計學意義(Plt;0.05)。各用藥組與模型組在24、72、168 h 3個時間段比較,左甲狀腺素鈉片中劑量組及左甲狀腺素鈉片高劑量組都明顯低于模型組。在168 h時間段，左甲狀腺素鈉片低劑量組與模型組、左甲狀腺素鈉片中劑量組與左甲狀腺素鈉片高劑量組比較有差異。左甲狀腺素鈉片中劑量組及左甲狀腺素鈉片高劑量組在24 h時間段與72、168 h兩個時間段比較有差異。模型組各時間段比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表3、圖1。

組別24h72h168h對照組9.44±2.86a10.05±3.12a10.25±2.90a模型組74.75±10.1368.55±11.4668.23±5.46左甲狀腺素鈉片低劑量組67.06±10.7658.72±9.9558.34±3.00c左甲狀腺素鈉片中劑量組58.50±5.60a43.93±13.40ab44.60±11.12ab左甲狀腺素鈉片高劑量組58.53±8.72a35.85±9.20ab36.49±8.29abdF96.35741.93476.232P0.0000.0000.000

a：Plt;0.01，與模型組比較；b：Plt;0.05，與同組24 h比較；c：Plt;0.01，與同時間段模型組比較；d：Plt;0.01，與同時間左甲狀腺素鈉片中劑量組比較

A:對照組；B：模型組；C～E:左甲狀腺素鈉片低、中、高劑量組

圖1各組大鼠腦損傷后72 h損傷處周圍額皮質細胞凋亡情況(×200)

2.3血清NSE水平 模型組與對照組比較，NSE水平明顯升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)。各用藥組在72、168 h兩個時間段與模型組比較，左甲狀腺素鈉片中劑量組及左甲狀腺素鈉片高劑量組NSE水平明顯低于模型組。各用藥組在24 h時間段與模型組比較，差異無統計學意義；模型組各時間段比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，見表4。

表4 各組血清NSE水平比較

a:Plt;0.05,與模型組比較

2.4血清IL-6水平 模型組與對照組比較，血清IL-6水平明顯升高。各用藥組在72、168 h兩個時間段與模型組比較，左甲狀腺素鈉片中劑量組及左甲狀腺素鈉片高劑量組IL-6水平明顯低于模型組(Plt;0.05)。各用藥組在24 h時間段與模型組比較，差異無統計學意義；模型組各時間段比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，見表5。

表5 各組血清IL-6水平比較

a:Plt;0.05,與模型組比較

3 討 論

甲狀腺素是神經系統分化、增殖、生長發育必不可少的激素。受此啟發，作者在研究重型顱腦損傷神經組織修復的可能影響因素時，考慮到了甲狀腺素的有利作用。為此本研究選擇神經細胞凋亡、炎癥介質、腦細胞特異酶等方面觀察外源性甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠神經組織的保護的影響。實驗發現補充外源性甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠的神經組織可能有保護作用。

首先，甲狀腺素可以改善重型顱腦損傷后的神經細胞凋亡。重型顱腦損傷造成的腦細胞損害除了腦細胞死亡外，還存在腦細胞凋亡[5]。同時有研究表示，神經細胞凋亡還參與了腦損傷后繼發性損害的病理生理過程[6-7]。并且有研究表明，腦組織凋亡細胞數與顱內壓、腦組織含水量在不同時期呈正相關,在總體的變化過程中也有正相關性[8]。腦損傷后存在神經細胞凋亡，已基本成為共識，但凋亡的程度在傷后的不同時間段會有所差別。

本實驗在SD大鼠上也觀察到重型顱腦損傷大鼠受傷后腦細胞即出現明顯的細胞凋亡，凋亡程度在1周內沒有多大改變。當用甲狀腺素干預后，中劑量及高劑量在用藥后24 h即可以明顯改善重型顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡，而低劑量在168 h后才能使神經細胞凋亡得到改善。Crupi等[9]在實驗中亦發現用T3對創傷性顱腦損傷小鼠進行干預治療，T3可以改善其神經行為功能，減少神經細胞凋亡，同時降低水腫以及挫傷體積。這些研究結果提示甲狀腺素可以減少顱腦損傷后神經細胞的凋亡，對腦組織有保護作用。

其次，甲狀腺素能夠降低重型顱腦損傷血清中腦細胞特異酶NSE濃度。NSE大部分存在于神經元、神經內分泌細胞中，腦組織損傷后，NSE被損傷的神經元釋放，進入腦脊液及體循環；腦損傷患者的神經細胞受到損害并發生瓦解,血腦屏障遭到破壞，其通透性增加,NSE釋放入體液中使外周血清中的NSE水平升高，血液中NSE水平升高意味著神經細胞受損,且與損傷程度呈正相關[10]。Scarna等[11]指出,腦脊液、血液中NSE水平的高低反映了腦神經元損傷部位的大小，以及損傷的嚴重程度,腦組織受損越嚴重,NSE釋放到血和腦脊液就越多。本研究觀察到重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血NSE濃度即明顯升高，一直持續至168 h。用不同劑量甲狀腺素對重型顱腦損傷大鼠進行干預后，中高劑量甲狀腺素在用藥后72 h即開始有對抗血清NSE升高的作用。說明甲狀腺素對顱腦損傷的腦組織有保護作用。

第三，甲狀腺素能夠減少重型顱腦損傷血清炎癥介質IL-6的釋放。 急性顱腦損傷后都會出現炎癥反應過程。其機制為腦組織缺血、缺氧以及細胞炎癥因子釋放，細胞因子炎癥反應導致腦細胞水腫、血腦屏障破壞、神經細胞死亡等，從而加重了腦水腫、腦組織缺氧，使得中樞神經系統進一步受損，IL-6作為主要的炎癥細胞因子在顱腦損傷后出現的炎癥反應過程發揮重要作用[12]。雖然IL-6在一定情況下對中樞神經系統有營養支持作用，影響著神經細胞的生長與分化，刺激神經元的炎癥細胞因子增生，能促進神經組織的修復，是機體免疫防護的重要介質[13]。然而另一方面，顱腦損傷后在IL-6等促炎細胞因子趨化作用下發生的繼發炎癥反應，會進一步加劇神經系統腦水腫而加重神經元損害。已有報道血清中IL-6水平的變化與急性的腦損傷程度呈正相關[14]。本研究觀察到重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6明顯升高，一直持續到168 h。用不同劑量甲狀腺素對重型顱腦損傷進行干預后，中劑量及高劑量甲狀腺素在72 h有抑制血清IL-6升高的作用。說明甲狀腺素可以改善顱腦損傷后繼發的炎癥反應，從而保護腦組織。

甲狀腺素對顱腦損傷大鼠腦組織的保護作用，其機制不是很清楚?？紤]可能與以下幾方面因素有關。一方面，顱腦損傷導致下丘腦功能障礙，引起血清甲狀腺素水平下降。補充甲狀腺素可以提高血清甲狀腺素濃度，使甲狀腺素濃度維持在腦組織代謝所需要的一定水平。Malekpour等[15]研究表明，重型顱腦損傷患者會出現下丘腦-垂體-軸功能障礙，導致血清T3、 T4水平降低，血清T3水平的降低與患者顱腦損傷的嚴重程度具有正相關性，而血清T4水平的降低影響患者的死亡率，并且呈正相關。本實驗在SD大鼠身上也觀察到，顱腦損傷大鼠血清中FT3、FT4在不同時間段均明顯下降。補充左甲狀腺素鈉后，可以對抗血清FT3、 FT4濃度的下降，并有不同程度的升高。另一方面，補充甲狀腺素可以通過釋放神經營養因子等途徑直接保護損傷的腦組織。有研究觀察到外源性T3可以顯著提高顱腦損傷小鼠腦源性和膠質細胞源性神經營養因子(BDNF和GDNF)[9]。Losi等[16]發現T3能夠對抗非基因組機制谷氨酸的毒性以保護大鼠海馬神經元。

[1]朱大年.生理學[M].7版.北京：人民衛生出版社，2008:355-357.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusion in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67-77.

[3]仁增，張躍康，馬潞，等.川芎嗪對大鼠重型顱腦損傷后神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax 表達的影響[J].中國臨床神經外科雜志，2009，14(1)： 37-39.

[4]張均田.現代藥理實驗方法[M].北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998：1241

[5]Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Am J Pathol，1995，147(6)：1575.

[6]Colicos MA，Dash PK.Apoptotic morphology of dentate gyanule cells following experimental cortical impact injury in rats：Possible role in spatial menory deficits[J].Brain Res，1996，739(2)：120-131.

[7]Clark RS，Cheng J，Watkins SL，et al.Apoptosis -suppressor gene Bcl-2 expression after traumatic brain injurey in the rats[J].J Neurosci，1997，17(23)：9172-9182.

[8]楊小鋒,龔江標,虞軍,等.創傷性顱腦損傷后細胞凋亡狀態與腦水腫、顱內壓的相關性研究[J].浙江預防醫學,2005,17(1):17-19.

[9]Crupi R,Paterniti I,Campolo M,et al.Exogenous T3 administration provides neuroprotection in a murine model of traumatic brain injury[J].Pharmacol Res，2013,70(1):80-89.

[10]陳晞,岑宇翔,陳盛強,等.顱腦損傷患者血清NSE的檢測及臨床意義[J].廣州醫藥,2005,36(3):14-15.

[11]Scarna H,Delafossa B,Steinberg R,et al.Neuron-specific enolase as a marker of neuronal lesions during various comas in man[J].Neurochem Int,1982,4(5):405-411

[12]Maier B,Schwerdtfeger K,Mautes A,et al.Differential release of interleukines 6,8,and 10 in cerebrospinal fluid and plasma after traumatic brain injury[J].Shock,2001,15(6):421-426.

[13]周鵬,袁志誠,李巧玉,等.顱腦損傷后血清TNF-α和IL-10的水平變化及意義[J].臨床神經外科雜志,2008,5(2):83-85.

[14]梁敏,湯樹洪,甘渭河.急性顱腦損傷后血清IL-6 IL-8 IL-10含量變化及意義[J].中國實用神經疾病雜志,2013,16(17):3-4.

[15]Malekpour B,Mehrafshan A,Saki F,et al.Effect of posttraumatic serum thyroid hormone levels on severity and mortality of patients with severe traumatic brain injury[J].Acta Med Iran，2012,50(2):113-116.

[16]Losi G,Garzon G,Puia G.Nongenomic regulation of glutamatergic neurotransmission in hippocampus by thyroid hormones[J].Neuroscience，2008,151(1):155-163.

Effectofthyroxinonneuronalapoptosis,serumNSEandIL-6inratswithseveretraumaticbraininjury*

DongFeifei1,PanYuzheng1△,PengLingling1,WeiJinbin2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China;2.SchoolofPharmacyofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveTo explore the protective effect of thyroxin on severe traumatic brain injury of brain tissue by observing the effect of thyroxin on neuronal apoptosis,serum neuronal specific enolase(NSE),interleukin-6(IL-6) and serum FT3 and FT4.MethodsA total of 90 SD rats was randomly divided into control group,model group,low dosage of levothyroxine sodium tablets group,moderate dosage of levothyroxine sodium tablets group and high dosage of levothyroxine sodium tablets group,18 rats in each group.The animal model was reproduced by referring to Feeney′s free fall impact modeling.Intragastric administration was performed at 6 h after injury.The levels of neuronal apoptosis and serum NSE,IL-6,FT3 and FT4 were detected by TUNEL method,ELISA method and radioimmunoassay at 24,72,168 h after intragastric administration.Results(1) After severe traumatic brain injury,the levels of serum FT3 and FT4 were under the normal and the level of FT4 was decreased to the lowest at 168 h.Thyroxine could increase the levels of FT3 and FT4.(2) Significant neuronal apoptosis was observed in rats with severe craniocerebral injury,and the apoptosis continued until 168 h.Moderate and high dose of thyroxine could improve neuronal apoptosis within 24 h,while low dose of thyroxine changed within 168 h.(3) The levels of serum NSE and IL-6 were increased significantly in rats after severe traumatic brain injury until 168 h,and they could be decreased by moderate and high dose of thyroxine within 72 h.ConclusionExogenous thyroxine can protect brain tissue in rats with severe traumatic brain injury.

thyroxine;severe traumatic brain injury;in situ nick-end labeling;serum neuronal specific enolase;interleukin-6

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.004

國家自然科學基金資助項目(81460687)；廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項(GZLC14-29)。

董菲菲(1990-)，碩士，主要從事中西醫結合腦病研究?！?/p>

，E-mail:pyz79298@sina.com。

R641

A

1671-8348(2017)32-4477-04

2017-04-15

2017-07-25)