吉非替尼對斑馬魚胚胎發育及腫瘤耐藥基因表達的影響

胡榮英，舒莉萍△，何志旭，孫琮杰，李志操，金 璐

(貴州醫科大學： 1.免疫學教研室；2.組織工程與干細胞中心；3.兒科學教研室，貴陽 550004)

·論著·

吉非替尼對斑馬魚胚胎發育及腫瘤耐藥基因表達的影響

胡榮英1,2，舒莉萍1,2△，何志旭2,3▲，孫琮杰1，李志操3，金 璐3

(貴州醫科大學： 1.免疫學教研室；2.組織工程與干細胞中心；3.兒科學教研室，貴陽 550004)

目的研究吉非替尼對斑馬魚早期胚胎發育及abcb4腫瘤耐藥基因表達的影響。方法實驗動物采用斑馬魚，實驗分為吉非替尼組、阿霉素和吉非替尼的混合液組、空白對照組。將吉非替尼稀釋成不同濃度梯度的藥液,分別處理受精后0.5～1.5 h(0.5～1.5 hpf)的斑馬魚胚胎，觀察胚胎和幼魚的死亡率、孵化率及畸形率變化。統計各濃度不同時間點的胚胎死亡率，計算出 IC50的數值；統計48 hpf和72 hpf的胚胎孵化率及120 hpf的畸形率；收集不同組別的斑馬魚胚胎，通過實時熒光定量PCR，檢測斑馬魚胚胎中abcb4基因的表達量。結果計算出吉非替尼在斑馬魚胚胎中的IC50為16.18 μmol/L。與對照組比較，高劑量吉非替尼(≥20 μmol/L)顯著抑制胚胎的孵化，并有明顯的胚胎致死效應和致畸效應；吉非替尼組的斑馬魚胚胎abcb4基因的mRNA水平變化不顯著，而阿霉素和吉非替尼的混合液組的abcb4基因的mRNA水平有明顯變化(Plt;0.05)。結論吉非替尼對斑馬魚早期胚胎中abcb4腫瘤耐藥基因的表達水平無明顯影響(Pgt;0.05)，但是吉非替尼能逆轉易耐藥藥物阿霉素的耐藥作用，提示使用斑馬魚可以構建腫瘤耐藥模型。

斑馬魚；吉非替尼；發育毒性；abcb4；抗藥性，多藥

腫瘤已成為疾病死因之首，發病率和病死率逐年攀升，因此腫瘤已成為非常重要的公共健康問題。目前，化療是腫瘤治療的主要方法，而抗腫瘤藥物的耐藥性是導致腫瘤化療失敗的主要原因。有研究發現，腫瘤耐藥和ATP結合盒(ATP-binding cassette,abc)轉運蛋白家族所介導的細胞藥物外排作用密切相關[1-2]。abc轉運體主要是將細胞內的藥物外排到細胞外，減少作用靶點的藥物濃度，從而產生耐藥性。abcb1是abc轉運體亞家族abcb的成員之一，高表達于大部分腫瘤耐藥細胞中[3-5]。對于abcb1基因的研究，目前主要在鼠類及耐藥細胞株中進行[6-7]，還少有關于用斑馬魚研究abcb1基因的相關報道，尤為重要的是目前還沒有很好的腫瘤耐藥篩選斑馬魚模型。本研究以斑馬魚為模型生物，將斑馬魚發育早期的胚胎用抗腫瘤藥物,表皮生長因子受體絡氨酸激酶抑制劑吉非替尼(gefitinib)進行暴露實驗，通過實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測斑馬魚abcb4基因在藥物暴露下的表達情況。為評價斑馬魚的abcb4基因在耐藥機制中的研究提供科學依據，也為在斑馬魚模型中進行抗腫瘤藥物篩選打下基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 斑馬魚由本實驗室所飼養的Tubingen品系，養殖方法參考zebrafish book。每日光照12 h，黑暗12 h，28 ℃左右條件下雌雄魚分缸飼養。采卵時取健康性成熟的斑馬魚按1∶1或1∶2的雌雄比例放入交配缸內，在燈照0.5 h后收集胚胎。收集的胚胎進行消毒和洗滌后移入裝有胚胎培養用水的一次性平皿中，28 ℃恒溫培養箱中進行培養。定時更換胚胎培養用水并吸出死胚胎，防止影響胚胎正常發育。

1.2主要儀器及試劑 儀器：體視顯微鏡(日本Nikon公司)；生化培養箱(中國科邁公司)；Bio-Rad CFX96TM Real-Time Systeam儀(美國Bio-Rad公司)；T100TMBio-Rad PCR。試劑：吉非替尼(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑First Strand cDNA Synthesis Kit(芬蘭Thermo公司)；IQTMSYBR Green Supermix試劑(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1吉非替尼溶液的配制及暴露方法 吉非替尼用含2‰的二甲基亞砜的雙蒸水配置成100 μmol/L的母液，分裝，避光保存于冰箱4 ℃備用。實驗前，用胚胎培養，用水進行梯度稀釋，配制吉非替尼最終濃度為0～40 μmol/L的實驗溶液，設置胚胎培養液為對照組。待胚胎發育到0.5～1.5 hpf，挑選出健康的胚胎于6孔板中進行暴露，每孔20枚胚胎，加5 mL溶液，置于28℃恒溫光照培養箱中以12 h∶12 h光周期培養，每天換液3次，觀察并記錄胚胎的發育，死亡、孵化和畸形等情況。

1.3.2藥物暴露劑量與毒性分析 根據吉非替尼濃度分為0 μmol/L(對照組)、1 μmol/L組、5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組，吉非替尼分別作用于受精后0.5～1.5 h(hours post-fertilization，hpf)的胚胎，統計分析每個濃度下24、48、72、96、120 hpf，5個時相胚胎的死亡率、孵化率和畸形率，繪制致死率、孵化率和畸形率的曲線圖，求出半數抑制濃度。實驗每組100枚胚胎，設置3個重復。本實驗采用吉非替尼在斑馬魚胚胎上的半數抑制濃度IC50=16.18 μmol/L為吉非替尼組的暴露濃度；阿霉素的暴露濃度選擇10 μmol/L[8]，另一實驗組為吉非替尼和阿霉素的混合液。阿霉素在斑馬魚上的毒性篩選，本課題組前期已經完成[8]。

1.3.3abcb4基因mRNA測定 根據各時間點斑馬魚胚胎的死亡率進行統計分析，得到吉非替尼的半數抑制濃度IC50，以此藥物濃度暴露下的胚胎為實驗組；對照組為胚胎培養液處理組。收集實驗組和對照組24、48、72、96、120 hpf 5個時相的斑馬魚胚胎各100枚，置于離心管中。加入TRIzol液，吹碎混勻,經氯仿、異丙醇、75%乙醇洗滌、晾干，加入適量DEPC水溶解。將所提RNA用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑反轉錄合成cDNA。用BIO-RAD CFX96TMReal-Time Systeam儀按照IQTMSYBR Green Supermix試劑反應體系進行擴增，擴增條件：95 ℃,10 min；95 ℃,15 s；58.3 ℃,20 s；72 ℃,20 s；40個循環。abcb4引物由課題組前期合成，基因相對表達量采用2-△△Ct值進行分析，實驗重復3次。

2 結 果

2.1吉非替尼對斑馬魚胚胎的致死毒性效應 觀察斑馬魚胚胎及幼魚的存活情況，與對照組相比，隨著藥物濃度的增高，胚胎死亡率逐漸增加。對照組、1 μmol/L組、5 μmol/L組和10 μmol/L組在各個時間點的死亡率相差不大。但是20 μmol/L組和40 μmol/L組胚胎死亡率逐漸升高，至120 hpf，40 μmol/L組死亡率達到90.83%。根據各時間點的死亡率進行統計分析，得到吉非替尼的半數抑制濃度IC50=16.18 μmol/L。各濃度下不同時間點胚胎的死亡率比較，見圖1。

圖1 暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚胚胎及幼魚死亡率

2.2吉非替尼對斑馬魚孵化率的影響 48 hpf時，與對照組相比，5 μmol/L組孵化率差異無統計學意義，10、20、40 μmol/L組孵化率均顯著降低；72 hpf時，10 μmol/L給藥組孵化率差異無統計學意義，20、40 μmol/L組孵化率均顯著降低，尤其是40 μmol/L組孵化率為33%，見圖2。

A：48 hpf孵化率；B：72 hpf孵化率

圖2暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚胚胎孵化率

2.3吉非替尼對斑馬魚發育畸形的影響 斑馬魚胚胎在36～72 hpf孵化，高濃度藥物對胚胎的孵化有抑制作用。為了便于觀察和統計，選擇120 hpf各實驗組，對幼魚的畸形率進行統計分析。隨著藥物濃度的增加，幼魚的畸形率逐漸升高。當藥物濃度為20 μmol/L時，幼魚的畸形率為53.47%；而40 μmol/L時，幼魚的畸形率高達100%，見圖3。

圖3 暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚幼魚畸形率

2.4吉非替尼對斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA的影響 吉非替尼組和對照組從72 hpf開始，abcb4基因mRNA水平開始隨胚胎時相的增加而升高，相同時相吉非替尼實驗組斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA的水平均與對照組無顯著變化(Pgt;0.05),見表1、圖4。但是當該濃度下的吉非替尼和臨床常用的易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素的混合液，在72、96、120 hpf這3個時相，相同時間點阿霉素和吉非替尼的混合液組斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA的水平均較阿霉素組明顯降低。72 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統計學意義(P=0.012 0)；96 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統計學意義(P=0.041 6)；120 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統計學意義(P=0.006 9)，見表2、圖5。

圖4 不同時相的斑馬魚胚胎abcb4基因的mRNA表達變化

組別24hpf48hpf72hpf96hpf120hpf對照組0.0013±0.00060.0840±0.01711.3549±0.23514.4264±1.009817.6398±0.9209吉非替尼0.0040±0.00290.1635±0.02021.4148±0.59664.8548±0.599718.1796±0.8846

表2 不同藥物各時相的斑馬魚胚胎abcb4基因的mRNA水平變化

a:Plt;0.05,b:Plt;0.01，與阿霉素組比較

圖5不同時相的斑馬魚胚胎abcb4基因的mRNA表達變化

3 討 論

吉非替尼屬于小分子表皮生長因子受體(EGFR)絡氨酸激酶抑制劑，通過與三磷酸腺苷競爭性結合，可抑制EGFR自磷酸化作用，抑制細胞周期蛋白依賴性激酶活性，使細胞周期停滯在G1期。目前吉非替尼廣泛應用于晚期非小細胞肺癌(NSCLC)治療的分子靶向藥物[9-10]。

研究發現吉非替尼能明顯逆轉紫杉醇在過表達abcb1的細胞株中的耐藥性，并增加紫杉醇在過表達abcb1的細胞株中的藥物濃度。由于吉非替尼對abcb1轉運功能有抑制作，使藥物外排作用減少，提高細胞內的藥物濃度[11]。吉非替尼在細胞上的毒性研究及對部分易引起耐藥的抗腫瘤藥物的逆轉耐藥作用有報道，但是吉非替尼在斑馬魚早期胚胎發育的毒性研究。對斑馬魚abcb4耐藥基因表達的影響；對易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素的耐藥性影響少見相關報道。

目前研究提示，abcb1基因與腫瘤耐藥關系密切，但其耐藥的詳細分子機制及以此為基礎篩選新的腫瘤藥物的研究模型還比較局限。目前耐藥性的研究主要使用小鼠及耐藥細胞株開展相關工作。由于小鼠生長周期長、使用成本高、基因操作技術制備模型動物的手段較復雜，使用有一定局限性；耐藥細胞株雖然操作簡便，但是不能反映機體整體情況。而斑馬魚具有胚胎體積小、周期短、胚胎透明、易觀察和技術操作容易等優點，故在胚胎發育毒性研究、藥物篩選和新藥開發中被廣泛應用，可作為藥物臨床前安全評估的重要體內模型[12-13]。

本課題組前期通過生物信息學分析，發現斑馬魚abcb4基因與人類耐藥相關基因abcb1的氨基酸序列相似度為64%[8]。有研究報道，斑馬魚abcb4基因與細胞內藥物吸收與積累量的變化情況有關[14-16]，但是關于abcb4基因在斑馬魚上具體耐藥機制和有關的腫瘤耐藥模型少見相關報道。

本研究對斑馬魚胚胎進行抗腫瘤藥物吉非替尼暴露后，急性毒性實驗結果表明吉非替尼對斑馬魚有明顯的發育毒性，能導致斑馬魚發育遲緩和畸變。與對照組相比，低劑量吉非替尼對斑馬魚胚胎無發育毒性，高劑量吉非替尼顯著抑制胚胎孵化率，并有明顯的胚胎致死率和畸形效應。斑馬魚死亡率和畸形率均隨給藥劑量的增加和給藥時間的延長而升高。通過死亡率計算出吉非替尼在斑馬魚胚胎發育早期中的IC50=(16.18±0.56)μmol/L。選用該藥物濃度為最大無毒性效應濃度對各時相的斑馬魚胚胎進行暴露，并收集胚胎。通過實時熒光定量PCR方法，檢測斑馬魚中abcb4基因的表達情況。本研究顯示，吉非替尼暴露后的斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA水平與對照組相比，表達無顯著差異；而阿霉素和吉非替尼的混合液與阿霉素單獨暴露后的斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA水平差異顯著，混合液組明顯降低了斑馬魚胚胎abcb4基因mRNA水平。

綜上所述，本研究證實了吉非替尼對斑馬魚abcb4基因表達水平無明顯變化，對易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素有逆轉耐藥的作用。說明斑馬魚中的腫瘤藥物耐藥性與abcb4基因有關，而人類該耐藥機制主要是由abcb1基因發揮作用，故本實驗證實斑馬魚abcb4基因與人的abcb1基因具有較高的同源性，且斑馬魚的abcb4基因表達水平的變化和同源基因在人細胞上研究一致。介于人類耐藥相關基因abcb1在腫瘤多藥耐藥中的重要性，由此推測斑馬魚中abcb4基因表達變化與多藥耐藥相關聯。因此，本文通過對斑馬魚abcb4基因的研究，為多藥耐藥轉基因斑馬魚模型建立以及抗腫瘤藥物在斑馬魚模型進行多藥耐藥性篩選奠定了重要實驗基礎。因此，可以選擇abcb4為靶基因進行操作，建立斑馬魚腫瘤多藥耐藥模型開展相關研究工作。另外，通過研究發現吉非替尼不僅不易引起耐藥，反而對易引起耐藥的藥物有逆轉耐藥的作用，因此在以后的臨床用藥中，可以考慮用吉非替尼和易耐藥的抗腫瘤藥物聯合應用于相關的臨床治療，這樣可以提高治療效果。同時，用斑馬魚構建腫瘤多藥耐藥模型，為以后新藥臨床前的耐藥性篩選及臨床用藥中藥物耐藥性的評價提供篩藥模型。提示臨床用藥時，對于易耐藥的藥物采用像吉非替尼這樣逆轉耐藥的藥物聯合運用，提高臨床療效。

由于抗腫瘤藥物種類繁多，且發生機制復雜。除吉非替尼、吉非替尼和阿霉素的混合液外，還需要選用更多不易耐藥的抗腫瘤藥物及吉非替尼和更多的易耐藥的藥物聯合運用進行驗證，從而檢測耐藥相關的基因、蛋白和相關的信號通路，以期進一步了解abcb4基因在斑馬魚多藥耐藥中的相關影響。

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Effectsofgefitinibonembryonicdevelopmentandexpressionoftumorresistancegenesinzebrafish*

HuRongying1,2,ShuLiping1,2△,HeZhixu2,3▲,SunCongjie1,LiZhicao3,JinLu3

(1.DepartmentofImmunology;2.CenterforTissueEngineeringandCellResearch;3.DepartmentofPediatrics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of gefitinib on early embryonic development and expression of abcb4 tumor resistance genes in zebrafish.MethodsZebrafish were adopted as experimental animals and divided into gefitinib group,mixture of doxorubicin and gefitinib group and blank group.Zebrafish embryos of 0.5-1.5 hours after fertilization(0.5-1.5 hpf) were exposed to different concentrations of gefitinib,and then embryo development of zebrafish in 24-120 hpf was observed and the number of death,hatch and malformation was recorded.The embryo mortality was calculated under different concentrations of gefitinib at different time points,and the numerical value of IC50was calculated;Hatching rates of zebrafish embryo in 48 hpf and 72 hpf and malformation rates of zebrafish embryo in 120 hpf were calculated.The zebrafish embryos exposed to different concentrations of gefitinib in different groups were collected,and the expression of abcb4 gene in zebrafish embryos was detected by real-time quantitative PCR.ResultsGefitinib IC50in zebrafish embryos was 16.18 μmol/L.Compared with the control group,higher dosage(20 μmol/L) of gefitinib in other two groups significantly decreased hatching rates of embryos,and had obvious embryonic lethal effects and teratogenic effects.Moreover,the mRNA levels of the abcb4 gene in the zebrafish embryos of gefitinib group were not significantly changed,whereas the mRNA levels of the abcb4 gene in mixture of doxorubicin and gefitinib group were significantly different(Plt;0.05).ConclusionGefitinib has no significant effects on the expression of abcb4 tumor resistance gene in early development of zebrafish embryos(Pgt;0.05),but it can reverse the drug resistant effects of doxorubicin,suggesting that zebrafish can construct tumor resistance model.

zebrafish;gefitinib;developmental toxicity;abcb4;drug resistance,multiple

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.002

國家自然科學基金資助項目(31460312)；貴州省重大應用基礎專項項目資助[(2015)2003]。

胡榮英(1990-)，在讀碩士，主要從事發育生物學的研究?！?/p>

，E-mail:gyslp456@gmc.edu.cn。▲共同通信作者，E-mail:hzx@gmc.edu.cn。

R965.1

A

1671-8348(2017)32-4469-04

2017-04-19

2017-06-17)