表達hCD4和hCCR5基因的骨髓間充質干細胞模型的建立

李雅婧，諸葛福艷，梁 娟，何金洋，譚 寧，曾常春△

(1.廣東醫科大學附屬龍華中心醫院，深圳 518110；2.桂林醫學院生物技術學院，桂林 541004；3.中山大學生命科學院，廣州 510275；4.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣州 510405；5.桂林醫學院廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室，桂林 541004)

·論著·

表達hCD4和hCCR5基因的骨髓間充質干細胞模型的建立

李雅婧1,2，諸葛福艷3，梁 娟2，何金洋4，譚 寧5，曾常春1,2△

(1.廣東醫科大學附屬龍華中心醫院，深圳 518110；2.桂林醫學院生物技術學院，桂林 541004；3.中山大學生命科學院，廣州 510275；4.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣州 510405；5.桂林醫學院廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室，桂林 541004)

目的研制一種能夠表達hCD4 和 hCCR5基因的骨髓間充質干細胞(MSCs)模型，以應用于Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)研究。方法構建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR慢病毒載體，按最佳感染復數轉染MSCs，熒光定量PCR檢測hCD4和hCCR5的 mRNA的表達，免疫印跡法檢測MSCs中hCD4和hCCR5蛋白的表達，免疫熒光法檢測hCD4和hCCR5熒光的表達；將建立的MSCs細胞進行HIV-1感染后，PCR檢測HIV RNA的表達。結果MSCs經轉染慢病毒載體后，hCD4和CCR5 mRNA凝膠電泳可見193 bp和75 bp的陽性條帶，mRNA的qRT-PCR檢測可見其表達升高(Plt;0.01)；Western blot檢測可見55.0×103(hCD4)和40.6×103(hCCR5)的陽性條帶；免疫熒光成像可見存在CD4和CCR5的熒光表達，而空載慢病毒載體呈陰性。轉染后MSCs細胞感染HIV-1后在培養細胞與上清液中HIV-1 RNA均顯著升高(Plt;0.05)。結論成功建立了高效表達hCD4/CCR5蛋白的骨髓間充質干細胞模型，具備對HIV-1易感的特性，可應用于HIV的發病機制、抗病毒、疫苗開發等研究。

骨髓間充質干細胞；HIV-1；細胞模型；hCD4/CCR5；基因表達

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV-1)選擇性地侵襲人體CD4+細胞，少數HIV-1分離株可以感染CD4+T細胞白血病細胞系，如CEM、Jurkat、Hut78細胞等[1]。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞[2]；易于分離、培養、擴增及外源基因的轉導和表達，且在體外培養的過程中始終保持多向分化的潛能，遺傳性能相當穩定[3]。此外，轉基因MSCs可以持續產生多種治療作用的蛋白質，對免疫缺陷疾病有潛在治療作用[4]。本研究通過慢病毒載體在MSCs細胞膜上加載hCD4和hCCR5分子，建立一種新的HIV-1易感的細胞模型，有利于促進HIV的發病機制、抗病毒及基因治療研究。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Gateway?BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway?LR ClonaseTMⅡ Plus Enzyme Mix購自Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司，質粒小提試劑盒購自TIANGEN公司，包裝質粒混合物(ViraPowerTMPackaging Mix)購自美國Invitrogen公司，標記有PE的抗體(CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166)均購自BD Biosciences公司；RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自于Takara公司。Maker為Thermo公司產品，CD4一抗為Abcam公司產品，CCR5一抗為Novus公司產品，二抗為中杉金橋公司產品，發光液為Thermo公司產品。

1.2方法

1.2.1質粒構建與慢病毒包裝 應用Gateway技術，將外源基因片段CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro導入慢病毒表達載體PLV.ExBi.P中，形成重組慢病毒質粒。制備慢病毒包裝載體，將構建的重組慢病毒質粒、pHelper 1和pHelper 2的輔助質粒共轉染293T細胞，產生假性病毒并進行測定，空載慢病毒作為轉染對照。

1.2.2細胞培養與轉染 MSCs購自Cyagen Bioscience Inc.。分離、純化 MSCs，置于含10%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 DMEM/F12的培養基中，5% CO2、37 ℃常規培養。轉染慢病毒后MSCs鑒定：檢測MSCs誘導成骨、成脂能力。當細胞融合率達到50%左右時，根據最佳感染復數(MOI)加入慢病毒表達載體的培養基2 mL，聚凝胺濃度為8 μg/mL，以空載慢病毒表達載體進行對照。

1.2.3MSCs中hCD4和hCCR5 mRNA的qRT-PCR檢測 收集第7、10、14天的細胞，Trizol 法提取總RNA。參照試劑說明書進行逆轉錄合成cDNA，以逆轉錄所得到的cDNA為模板進行RT-PCR。實驗過程設計空白細胞、轉染空載體細胞為陰性對照、以GAPDH作為內參對照。引物序列為：CD4(上游引物：5′-TGC CTC AGT ATG CTG GCT CT-3′；下游引物：5′-GAG ACC TTT GCC TCC TTG TTC-3′)；CCR5(上游引物：5′-GCT GGT CAT CCT CAT CCT GAT AA-3′，下游引物：5′-ATG GCC AGG TTG AGC AGG TA-3′)和GAPDH(上游引物：5′-TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC-3′，下游引物：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3′)。ABI7500實時熒光定量PCR儀進行檢測，反應程序為：95 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。

1.2.4MSCs中hCD4和hCCR5蛋白的Western blot檢測 提取MSCs的細胞總蛋白，配制10%的聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉膜、染膜、裁膜、脫脂牛奶封膜1 h、一抗孵育4℃過夜、TBST洗滌一抗5次(每次20 min)、脫脂牛奶封閉30 min、二抗孵育1 h、TBST洗滌二抗5次(每次5 min)、發光成像。

1.2.5MSCs中hCD4和hCCR5的免疫熒光法檢測 細胞生長融合再次達到70%左右時，用預溫的1×PBS洗3次，每次5 min；4%的甲醛室溫固定20～30 min；1×PBS洗3次，每次5 min；4% BSA室溫封閉30 min；加1%BSA稀釋的一抗放在濕盒里，4 ℃孵育過夜；1×PBS洗3次，每次5 min；加1%BSA稀釋的二抗閉光孵育30 min；1×PBS洗3次，每次5 min；激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6MSCs的HIV-1感染及qRT-PCR檢測 當MSCs細胞融合率達到50%左右時，進行HIV-1感染。于感染后2、4、6、8、10 d分別留取培養細胞及其上清液備檢。采用探針法和核苷酸膠體染料法qRT-PCR法分別檢測上清液中及細胞內HIV-1 RNA水平。引物序列為：HIV-1(上游引物：STT TTA RYC CAG AAG TAA TAC CCA TGT T；下游引物：GCA GCY TCY TCA TTG ATG GT)；探針序列為：FAM- ACT ATG TCC ACC TGC CAT TAA GCC CGA GA-TAMRA。

2 結 果

2.1慢病毒載體的構建結果 通過Gateway技術，將外源基因片段CMV-CD4-IRES-CCR5導入慢病毒表達載體中，構建的示意圖及其鑒定見圖1。CMV為啟動hCD4基因表達的啟動子；IRES序列連接hCD4和hCCR5基因，并為hCCR5的啟動子；Puro為抗性基因，Pgk為其啟動子(圖1A)。在100及200 bp的下側各見一條陽性條帶，與引物設計的目的片段hCD4和hCCR5的理論大小193 bp和75 bp相對應，表明為hCD4和hCCR5的陽性克隆(圖1B)。

A：hCD4/CCR5慢病毒包裝載體結構示意圖；B：瓊脂凝膠電泳結果，Maker為500 bp

圖1 hCD4/CCR5慢病毒載體結構及鑒定結果

A：凝膠電泳結果；B：qRT-PCR結果；a：Plt;0.01

圖2 MSCs中hCD4/CCR5 mRNA水平的qRT-PCR檢測結果

2.2hCD4/CCR5的mRNA表達結果 轉染后MSCs的hCD4和hCCR5 mRNA瓊脂糖凝膠電泳檢測與qRT-PCR結果見圖2。于100及200 bp標準帶下側各有1條陽性條帶，與hCD4和CCR5理論大小193 bp和75 bp相對應，而空載組(M-V)和未感染組(N-T)未見該陽性條帶(圖2A)；MSCs慢病毒轉染后第7、10、14天的qRT-PCR結果顯示，與N-T組相比，hCD4和hCCR5的mRNA表達均升高(Plt;0.01)，見圖2B。

圖3 MSCs中hCD4/CCR5蛋白的Western blot檢測結果

A、B：空白對照組MSCs細胞形態的顯微成像結果；C、D：MSCs感染空載病毒后的熒光結果；E、F：MSCs轉染慢病毒后hCD4分子的熒光顯微成像結果；G、H：轉染后hCCR5分子的熒光成像結果

圖4 MSCs中hCD4/CCR5的免疫熒光法檢測結果(×400)

2.3hCD4/CCR5蛋白的表達結果 提取MSCs的總蛋白，以β-actin為內參，hCD4和hCCR5蛋白的Western blot檢測結果見圖3。轉染后MSCs組(T)可見與CD4和CCR5蛋白已知大小(分別為55.0×103和40.6×103)相符合的陽性條帶，表明MSCs中存在CD4和CCR5蛋白的表達；而在空載組(M-V)和未感染組(N-T)中，未見該條帶的表達。

2.4hCD4/CCR5的熒光表達結果 hCD4/CCR5的免疫熒光顯微成像結果見圖4。MSCs轉染慢病毒后，在細胞核和細胞膜上可見CD4分子的熒光表達；在細胞核和細胞膜上可見CCR5分子的熒光表達。

2.5MSCs細胞感染HIV-1后HIV-1 RNA的表達結果 轉染后MSCs細胞進行HIV-1感染，培養細胞及上清液的HIV-1 RNA檢測結果見圖5。培上清液的HIV-1 RNA在第2、4、6、8天升高(Plt;0.05)，見圖5A。MSCs細胞內的HIV-1 RNA在第2、6、8天升高(Plt;0.05)，見圖5B。

A：上清液的HIV-1RNA表達水平；B：細胞內的HIV-1 RNA表達水平；a:Plt;0.05

圖5 MSCs感染HIV-1后上清液與細胞內

HIV-1 RNA結果

2.6MSCs誘導成脂、成骨能力的檢測結果 成脂誘導后，隨著誘導時間的延長，含脂滴細胞逐漸增多細胞體積逐漸增大，由原來的長梭形變為圓形或多角形(圖6B)。誘導14 d后，脂肪細胞中含大小不等的脂滴，脂滴被染成橙紅色(圖6C)。成骨誘導后1周，大約80%以上的MSCs形態不規則，成為多角形，細胞基質中出現鈣化斑(圖6E)；2～3周時，成骨誘導組細胞基質形成多層小結結構，鈣化物形成明顯，并形成鈣化結節(圖6F)。圖6A、D則作為空白對照。

A、D：空白對照；B：圓形或多角形含脂滴細胞；C：脂滴被染成橙紅色；E：細胞基質中出現鈣化斑；F：形成鈣化結節

圖6 MSCs誘導成脂、成骨能力的檢測結果(×400)

3 討 論

MSCs作為基因治療的潛在工具得到很大的關注[5-6]。對動物移植的大量研究發現，MSCs具有多項分化潛能，能夠分化為成骨細胞[7]、軟骨細胞[8]、心肌細胞[9]、神經細胞[10]、上皮細胞[11]、以及造血細胞[12]。更重要的是，MSCs可以導入外源基因，并保持轉基因在體內有效且持續的長期表達[13]。近年來在抗HIV感染的各類研究中，基因治療有著快速的發展[14]。慢病毒載體介導的MSCs不僅是一個新的HIV-1易感的細胞模型，而且在傳染病的基因治療方面，MSCs基因療法也是一個新的亮點。

慢病毒載體作為一種有效且多用途的基因轉移工具，與其他逆轉錄病毒相比，不但能轉導分裂細胞，而且能轉導非分裂細胞且能保持持久的轉基因表達。基于HIV-1的慢病毒載體，在轉導效率和轉導方式上都優于其他逆轉錄病毒，是目前應用研究最廣泛的載體。hCD4分子是一種膜分子，主要表達于輔助T(Th)細胞，也是HIV-1入侵細胞的主要受體[15]；hCCR5，作為G蛋白偶聯因子超家族(GPCR)成員的細胞膜蛋白，是細胞內β趨化因子(RANTES、MIP-1α和MIP-1β)的受體，亦是HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一[16]。部分HIV人類細胞模型是通過加載hCD4和hCCR5建立的，例如TZM-bl細胞系[17]，是一種基于穩定表達CD4和CCR5基因的人宮頸癌HeLa細胞，廣泛應用于HIV-1感染的研究。本實驗設計的慢病毒載體是在CMV啟動子的轉錄控制下含有hCD4和hCCR5基因的慢病毒。

培養的MSCs細胞，根據空載慢病毒載體獲得的最佳MOI結果進行慢病毒載體感染。經轉染后，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，hCD4和hCCR5的條帶與理論大小一致，而qRT-PCR結果更進一步說明可以陽性表達hCD4和hCCR5 mRNA，并且隨天數具有增加的趨勢。提取MSCs的蛋白質進行了Western blot檢測，實驗結果顯示MSCs中有hCD4和hCCR5蛋白的表達。免疫熒光的結果進一步顯示hCD4和hCCR5可以在MSCs的細胞膜上表達。經鑒定成功轉染慢病毒后的MSCs仍具有干細胞的特性，此細胞模型是可穩定表達外源基因且正常傳代的細胞株。簡而言之，本實驗中應用慢病毒載體，成功地將hCD4和hCCR5導入于MSCs細胞并實現了高效表達。

本研究中所制備的高效表達hCD4/hCCR5的MSCs細胞，主要是應用于HIV-1易感細胞模型研究。HIV-1主要侵犯人體的CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，其感染過程包括病毒的吸附、侵入、逆轉錄、基因組的整合、表達及釋放等過程[18]。轉染慢病毒后的MSCs細胞，可以高效地表達hCD4和hCCR5蛋白，也就是說具備了HIV-1感染的受體與輔助受體，為HIV-1的入侵感染準備了基本條件。通過HIV-1對研制的MSCs細胞的感染驗證，qRT-PCR檢測結果顯示其培養上清液和細胞裂解液中均可以檢測到HIV-1 RNA，這證實HIV-1可感染本研制的MSCs細胞，并且HIV-1在細胞內能整合和實現病毒完整的復制。

綜上所述，本研究通過慢病毒載體成功且高效地將CD4和CCR5基因轉入MSCs中，并證實這種轉基因的MSCs可以支持HIV-1的有效入胞、整合和復制。一種新的可以穩定表達hCD4/CCR5的細胞模型成功建立，作為HIV-1的宿主細胞，這種細胞模型對HIV/AIDS的發病機制及治療的進一步研究有很大的幫助。

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EstablishmentofamesenchymalstemcellsmodelstablyexpressinghCD4andhCCR5*

LiYajing1,2，ZhuGeFuyan3，LiangJuan2，HeJinyang4，TanNing5，ZengChangchun1,2△

(1.AffiliatedLonghuaCentralhospital,GuangdongMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518110,China;2.SchoolofBiomedicalTechnology,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541004,China;3.SchoolofLifeSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong510275,China;4.TropicalMedicineInstitute,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510405,China;5.GuangxiKeyLaboratoryofMolecularMedicineinLiverInjuryandRepair,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541004,China)

ObjectiveTo establish a kind of mesenchymal stem cells(MSCs) model that could express hCD4 and hCCR5 to study the field of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1).MethodsLentiviral vectors containing the genes of hCD4 and hCCR5 under the transcriptional control of cytomegalovirus promoter were designed.MSCs were transfected by the lentiviral vectors at optimum multiplicity of infection.Transduction efficiencies of hCD4 and hCCR5 in MSCs were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR),Western blot,and immunofluorescence staining.Subsequently,the transfected human MSCs were infected with HIV-1,and the expression of HIVRNA in the MSCs was detected by RT-PCR.ResultsThe MSCs model containing hCD4 and hCCR5 and supporting normal HIV-1 infection was constructed.qRT-PCR showed that MSCs upon infection with lentiviral vectors were highly expressed in hCD4 and CCR5 mRNA sequences(Plt;0.01).Western blot detection showed the positive bands of 55.0×103(hCD4) and 40.6×103(hCCR5).The results of immunofluorescence staining revealed that hCD4 and CCR5 were expressed on the surface of MSCs.Such results were not found in cells infected with empty lentiviral vectors.And the susceptibility of the hCD4/CCR5 transgenic MSCs to the HIV-1 was further indicated by the detection of HIV-1 RNA in the culture supernatants and cell lysates(Plt;0.05).ConclusionThe MSCs model that could highly express hCD4 and hCCR5 was established to support normal HIV-1 infection,which can be used to investigate the development of new therapies and vaccines against HIV.

mesenchymal stem cells;HIV-1;cell model;human CD4 and CCR5;gene expression

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.001

國家自然科學基金資助項目(81660755；81573861)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20170307160524377)。

李雅婧(1993-)，碩士，主要從事HIV跨物種感染研究。△

，E-mail:373821547@qq.com。

R-331;R373.9

A

1671-8348(2017)32-4465-04

2017-04-18

2017-06-16)