實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術在疑似肺結核早期診斷中的臨床意義

江萬航 衛安娜 龐慧敏 譚守勇

·論著

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術在疑似肺結核
早期診斷中的臨床意義

江萬航 衛安娜 龐慧敏 譚守勇

目的探討實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simultaneous amplification and testing，SAT)用于疑似肺結核早期診斷的臨床意義。方法分析2015年7—12月廣州市胸科醫院收治的呼吸道疾病患者338例，其中疑似肺結核患者242例(疑似肺結核組)，臨床已排除肺結核的肺部其他疾病患者96例(對照組)。所有患者同時進行了痰SAT檢測、抗酸桿菌涂片、分枝桿菌培養和菌種鑒定等檢查；統計疑似肺結核患者菌種鑒定結果，對SAT檢測與結核分枝桿菌(MTB)培養及菌種鑒定結果的符合率、SAT檢測診斷疑似肺結核的敏感度和特異度進行分析。結果疑似肺結核組242例患者中痰培養陽性233例，菌種鑒定為MTB感染者222例，非結核分枝桿菌(NTM)感染者11例；痰培養結果為陰性的患者9例。對照組患者痰培養結果均為陰性。菌種鑒定為MTB感染者SAT檢測陽性192例，SAT檢測與菌種鑒定符合率為86.5%(192/222)；菌種鑒定為NTM感染者SAT檢測陽性0例(0/11)，與菌種鑒定符合率為100.0%(11/11)；對照組SAT檢測陽性者2例(2.1%，2/96)，與分枝桿菌培養符合率為97.9%(94/96)。SAT在疑似肺結核患者診斷中的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)。結論在疑似肺結核患者中開展SAT檢測對肺結核早期診斷具有重要臨床意義。

結核，肺； 核酸擴增技術； 早期診斷； 分枝桿菌感染, 非典型性； 呼吸道疾病

早期、及時、準確診斷是肺結核診治的關鍵，隨著分子生物學技術的發展，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simultaneous amplification and testing，SAT)進入了結核病診斷領域，其具有檢測時間短，敏感度、特異度高的特點，逐漸引起臨床重視。有文獻報道，SAT檢測不僅可快速檢測痰標本中的結核分枝桿菌(MTB)，而且可判斷待檢痰液中MTB是否為活菌[1]，2～3 h即可獲得檢測結果[2]，在耗時和檢測成本上均低于Xpert MTB/RIF法[3]，且試驗要求較熒光PCR擴增法低[4]，可快速、準確地對肺結核做出早期診斷[5]。

本研究回顧性分析2015年7—12月廣州市胸科醫院收治的痰抗酸桿菌涂片連續3次陽性的疑似肺結核患者242例，同時納入臨床已排除肺結核的肺部其他疾病患者96例，進行了痰SAT檢測、分枝桿菌培養和菌種鑒定等檢查，探討在疑似肺結核患者中開展SAT檢測對肺結核早期診斷的臨床意義。

對象和方法

一、研究對象

1.疑似肺結核組：對2015年7—12月在廣州市胸科醫院結核科住院的所有呼吸系統疾病患者進行篩查，符合下列條件的患者進入本研究：痰抗酸桿菌涂片連續3次陽性，同時完成痰SAT檢測、分枝桿菌培養和菌種鑒定等檢查；剔除檢查資料不完整的患者。入組疑似肺結核患者242例，其中男158例，女84例；年齡18～70歲，平均(47.5±11.6)歲。肺結核的臨床診斷依據文獻[6]。

2.對照組：收集同期廣州市胸科醫院收治的臨床已排除肺結核的肺部其他疾病患者96例，其中男55例，女41例，年齡28～68歲，平均(43.3±10.1)歲；包括慢性阻塞性肺疾病58例(60.4%)，肺炎17例(17.7%)，肺癌5例(5.2%)，支氣管擴張9例(9.4%)，肺曲霉菌病5例(5.2%)，塵肺2例(2.1%)。上述患者的診斷均依據相關診斷標準[7-8]。

本研究所有患者HIV檢查均為陰性。本研究通過廣州市胸科醫院倫理委員會的審批。

二、研究方法

標本涂片根據《結核病診斷實驗室檢驗規程》[9]處理，經金胺“O”-羅丹明熒光染色檢測分枝桿菌，應用BACTEC MGIT 960 和專用培養基進行分枝桿菌分離培養，采用常規生化鑒定法和基因芯片法進行菌種鑒定。SAT檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供。

痰標本留?。喝朐汉蟮诙?，患者于清晨漱口后，同時留取1次痰SAT檢測標本、3次痰抗酸桿菌涂片標本、1次痰分枝桿菌培養標本，對于培養陽性標本進一步行菌種鑒定，陽性報告結果為MTB生長或非結核分枝桿菌(NTM)生長。痰涂片及培養操作按《現代結核病診斷技術》[10]進行。

菌種鑒定的方法和試劑：對培養陽性的標本進行涂片鏡檢，做MPB64分泌蛋白抗原檢測，檢測陽性標本加做對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗，確認是否為MTB。MPB64分泌蛋白抗原檢測陰性培養物進行晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定[11]。MPB64分泌蛋白抗原檢測試劑盒由杭州創新生物檢控技術有限公司提供，晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧晶典生物技術有限公司提供。

三、統計學分析

采用Excel 2007表收集試驗數據，使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析。敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%。

結 果

一、分枝桿菌培養及菌種鑒定結果

242例疑似肺結核患者，痰培養陽性233例；其中菌種鑒定結果為MTB感染者222例，菌種鑒定結果為NTM感染者11例。痰培養結果為陰性的患者9例，結合臨床資料，此9例患者最終確診為涂陽培陰肺結核患者。對照組患者培養結果均為陰性。

二、SAT檢測的符合率

疑似肺結核組以菌種鑒定結果為金標準，培養陽性菌種鑒定結果為MTB感染的222例患者中SAT檢測陽性者192例，SAT檢測結果與菌種鑒定結果的符合率為86.5%(192/222)；培養陽性菌種鑒定結果為NTM感染的11例患者中SAT檢測陽性者0例(0/11)，與菌種鑒定結果的符合率為100.0%(11/11)；對照組SAT檢測陽性者2例(2.1%，2/96)，均為肺炎患者，與MTB培養的符合率為97.9%(94/96)。

表1 SAT檢測結果在不同組別患者中與培養及菌種鑒定結果的比較

注“培養”指痰分枝桿菌培養

三、SAT在疑似肺結核患者診斷中的意義

SAT對疑似肺結核患者診斷的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)(表1)。

討 論

一、SAT檢測對疑似肺結核的診斷效率評估

從本研究結果可以看出，以菌種鑒定結果作為金標準，非結核病患者為陰性標準，SAT檢測在疑似肺結核診斷中的敏感度為86.5%，特異度為97.9%。從檢測時間上看，SAT檢測只需2～3 h就能得到結果，速度明顯快于培養法[2]，而檢測結果與培養法一致率達86.5%，說明SAT檢測能夠在較短的時間內提供準確率為86.5%的檢測結果。本研究9例培養陰性的臨床診斷肺結核患者的標本有2例 SAT檢測為陽性，提示SAT檢測有助于早期快速發現傳染源、及時診治肺結核患者，減少結核病的傳播。

將本研究與蔡杏珊等[11]和黃芳等[12]國內同類研究比較，結果相仿；但崔振玲等[13]研究報道的對于痰涂片陽性的標本，SAT檢測對肺結核的診斷敏感度可達97.6%。本研究222例培養陽性、菌種鑒定為MTB的患者中有30例SAT檢測結果為陰性，SAT檢測與菌種鑒定的符合率為86.5%，而非100.0%，說明可能產生了假陰性結果，也可能由于本研究的痰SAT和涂片培養檢測不是同一份痰標本，標本的異質性可能導致不同方法的檢出結果出現差異。每例患者多份標本進行SAT檢測可能會提高陽性檢出率。

崔振玲等[13]研究報道，SAT檢測對臨床確診的肺結核患者痰標本檢出率為54%，高于羅氏培養法(42%)，未發現假陽性現象；本研究對照組出現2例假陽性，均為肺炎患者。雖然RNA在環境中極易降解，不容易發生實驗污染，出現假陽性的概率較低，但本研究中SAT-TB檢查仍有2例假陽性，經患者追蹤，此2例肺炎患者經抗炎治療后病灶完全吸收，排除肺結核。提示在實驗室操作環節仍有出現標本污染的可能，應嚴格規范各項操作，避免人為因素降低其檢驗效能。

將SAT技術與目前其他分子生物學診斷方法，如Xpert MTB/RIF進行比較，張青和閆麗萍[14]Meta分析顯示，用Xpert MTB/RIF診斷肺結核的敏感度為89%，特異度為98%。本研究顯示SAT檢測效能與Xpert MTB/RIF相比，有較高的診斷肺結核的敏感度和特異度，同時檢查成本較Xpert MTB/RIF更低。

二、SAT檢測在NTM肺病診斷中的應用

SAT的檢測周期短，除了和培養法一樣能夠檢測鑒別活菌外，還能區分MTB與NTM感染。近年來，隨著AIDS的流行，醫原性感染機會增多，各種免疫抑制劑的使用，人口老齡化等問題，NTM肺病較以前明顯增加，已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題[15]。單憑涂片法和培養法難以區分NTM菌株。在無菌種鑒定結果的情況下，NTM肺病可長期被誤診為結核病[16]。本研究入組的242例疑似肺結核患者，痰抗酸桿菌涂片連續3次陽性并同時進行了痰SAT檢測、MTB培養和菌種鑒定等檢查。菌種鑒定結果顯示，MTB感染者222例，NTM感染者11例，NTM菌株在疑似肺結核患者中的檢出率為4.5%(11/242)。劉志輝等[17]報道，1994—2003年10年間廣州市結核病肺部腫瘤防治所門診患者的NTM分離率在3.51%～10.06%之間，平均分離率為6.28%。羅春明等[18]報道廣州地區2003—2012年10年間的NTM分離率高達20.00%，年分離率從2003年的12.87%上升至2012年的24.22%。

臨床確診NTM肺病的金標準是分枝桿菌培養和菌種鑒定，耗時長且需要使用不同類型的培養基和培養溫度使細菌獲得最優生長[19]，不能滿足臨床早期快速診斷的需要，有一定的局限性。

建議對于痰抗酸桿菌涂片陽性患者，有胸部影像學檢查結果支持，考慮診斷為肺結核前，可行SAT檢測協助診斷，并行分枝桿菌培養及菌種鑒定。SAT檢測陽性，支持肺結核的診斷，再開始進行抗結核治療；SAT檢測陰性，需排除NTM肺病，等待分枝桿菌培養及菌種鑒定結果。采用此方法，可降低耗時和檢測成本，對于早期避免誤診和漏診具有重要意義。

三、小結

綜上所述，SAT檢測在2～3 h內可以準確獲得檢測結果，在臨床簡單易行，在疑似肺結核患者中開展SAT檢測，對肺結核早期診斷及減少漏診、誤診具有重要臨床意義。

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2017-05-10)

(本文編輯：郭萌)

Clinicalsignificanceofusingthesimultaneousamplificationandtestingmethod(SAT)intheearlydiagnosisofsuspectedpulmonarytuberculosis

JIANGWan-hang,WEIAn-na,PANGHui-min,TANShou-yong.

GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email: 13802930679@163.com

ObjectiveTo investigate the clinical significance of using the simultaneous amplification and testing method (SAT) in the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.MethodsThree hundred and thirty-eight cases with respiratory disease (including 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis and 96 cases with non-tubercular and other lung diseases) admitted in Guangzhou Chest Hospital from July to December 2015 were recruited in the study. Sputum samples were submitted for testing for SAT, smear, culture and strain identification. The number of cases of infection withMycobacteriumtuberculosis, and non-tuberculosis mycobacteria were determined. The coincidence rate of SAT and MTB culture, SAT and strain identification were calculated, and the sensitivity and specificity of SAT in the detection of suspected pulmonary tuberculosis was determined.ResultsOf the 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis, 233 cases were sputum culture positive, 222 cases were infected withMycobacteriumtuberculosis, and 11 cases with non-tubercular mycobacteria, 96 cases with non-tubercular and other lung diseases were sputum culture negative. In the MTB group, 192 cases were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 86.5% (192/222). In the NTM group, no case (0/11) were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 100.0% (11/11). Of the 96 cases with non-tubercular and other lung diseases, 2 cases were SAT positive (2.1%, 2/96), and the coincidence rate of SAT with MTB culture and strain identification was 97.9% (94/96). The sensitivity of SAT in the diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis was 86.5% (192/222), and the specificity was 97.9% (94/96).ConclusionThe use of the SAT assay has important clinical significance for the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Mycobacterium infections, atypical; Respiratory tract diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.011

廣州市科技計劃課題(155700012)

510095 廣州市胸科醫院

譚守勇，Email：tanshouyong@163.com