盆腔神經損傷與IL-10相互作用在子宮腺肌病中的研究

蔡瑤瑤 徐欣欣 吳雪清

盆腔神經損傷與IL-10相互作用在子宮腺肌病中的研究

蔡瑤瑤 徐欣欣 吳雪清

目的 研究子宮腺肌病患者宮骶韌帶及輸卵管峽部神經損傷情況及血清IL-10水平，為子宮腺肌病的發病機制研究提供新的思路。方法 選取因子宮腺肌病行腹腔鏡下全子宮+雙側輸卵管切除術的33例患者作為實驗組，同期因子宮頸上皮內腫瘤III級及子宮肌瘤行相同手術的32例患者作為對照組，拍攝并記錄兩組患者腹腔鏡下宮骶韌帶形態學改變，測定宮骶韌帶及輸卵管峽部蛋白基因產物9.5（PGP 9.5）表達情況，并采用ELISA法測定兩組患者血清IL-10水平。結果 實驗組患者宮骶韌帶在腹腔鏡下表現為不同程度的損傷及中斷，輸卵管峽部黏膜層和肌層PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度較對照組明顯減少（均P＜0.05）。兩組患者輸卵管漿膜層PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達的陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組患者在血管壁周圍可見異常增生的神經纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。實驗組患者血清IL-10水平較對照組明顯上升（P＜0.05）。結論 子宮腺肌病患者宮骶韌帶神經、輸卵管近端黏膜層及肌層處神經即宮骶韌帶上行的神經通路出現不同程度的損傷，且血清IL-10水平明顯升高，盆腔神經損傷與炎癥相互作用可能與子宮腺肌病的發生、發展相關。

子宮腺肌病 宮骶韌帶 神經纖維 神經損傷 IL-10

子宮腺肌病是子宮內膜腺體及間質侵入子宮肌層，在激素的影響下發生出血、肌纖維結締組織增生，形成彌漫或局限性的病變，是婦科常見病之一，好發于40～50歲經產婦。其主要臨床表現為經量增多、經期延長和進行性痛經，還可伴有慢性盆腔痛、性交痛等，嚴重影響患者的生活質量[1]。近年來，該病發病率呈上升趨勢，其病因與發病機制至今尚不清楚[2]。神經纖維的異常分布及機體的免疫反應異常成為近年來研究的熱點之一。蛋白基因產物9.5（PGP 9.5）是高度特異性的神經標志物，可檢測有髓神經纖維（包括 Aa、Aβ、Ay、Aδ、B）與無髓神經纖維（包括C）[3]。神經損傷后會分泌多種細胞因子促進自我修復，IL-10是主要的抗炎癥因子之一，在很多慢性疾病及惡性腫瘤中充當重要角色[4]。本研究旨在通過檢測子宮腺肌病患者宮骶韌帶及輸卵管峽部PGP 9.5表達情況及血清IL-10的水平，從而探討盆腔神經損傷、血清IL-10水平與子宮腺肌病的關系，為子宮腺肌病的發病機制研究提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年10月至2016年5月在本院行腹腔鏡下全子宮+雙側輸卵管切除術的子宮腺肌病患者 33 例作為實驗組，年齡 37～57（45.9±4.2）歲，人工流產次數 0～10（1.5±1.8）次，術后經病理學檢查確診。選擇同期行腹腔鏡下全子宮+雙側輸卵管切除術的子宮頸上皮內腫瘤Ⅲ級及子宮肌瘤患者32例作為對照組，年齡 32～57（47.5±3.9）歲，人工流產次數 0～2（0.6±0.7）次，并排除術后病理診斷為盆腔子宮內膜異位癥、子宮腺肌病的患者。兩組患者年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者均無吸煙史，無神經疾病史，無盆腔手術史及盆腔炎病史，術前6個月內均未服用性激素類藥物，未放置宮內節育器。本研究獲得醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 腹腔鏡采圖方法 術中連接腹腔鏡機組拍攝并記錄宮骶韌帶形態學改變及鄰近腹膜表面的血管新生情況。

1.2.2 免疫組織化學測定 兩組患者均行全子宮+雙側輸卵管切除術，術中避免牽拉和電損傷輸卵管組織，將標本固定在甲醛溶液中24h后，選取輸卵管峽部約5mm的組織及宮骶韌帶組織，取材過程中避開術中電凝組織部分。組織經10%甲醛固定、脫水、浸蠟，常規石蠟包埋，以4μm厚連續切片。采用免疫組織化學En－Vision兩步法，一抗為 PGP 9.5抗體（1∶200稀釋，北京中杉金橋生物技術有限公司），以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，37℃孵育10min，用二氨基聯苯氨（DAB）顯色，蘇木素復染。

1.2.3 神經纖維密度測定 采用Olympus BX43光學顯微鏡及圖像采集系統（北京瑞科中儀科技有限公司）對免疫組織化學切片進行計數并拍片。神經纖維密度的計算方法：先在低倍鏡（×100）下選取PGP 9.5陽性高表達區，再轉換成高倍鏡下（×400）計數視野中神經纖維的數目，根據標尺長度計算400倍視野的實際面積為0.237mm2，用所計數的神經纖維數目除以0.237mm2，計算得到每mm2組織中神經纖維的數量，即神經纖維密度。計數5個高倍視野下PGP 9.5陽性神經纖維數，并計算平均神經纖維密度。

1.2.4 血清IL-10水平測定 無菌狀態下采取實驗組患者21例及對照組患者19例靜脈血5ml（排除兩組患者中有免疫性疾病、內分泌疾病等其他系統慢性疾病史及肝腎功能異常者），以3 000r/min離心10min，取上清液-80℃保存待測。采用ELISA法測定血清中的IL-10水平，試劑盒由上海西唐生物有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。兩組輸卵管神經纖維密度的檢測結果以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；兩組患者輸卵管峽部及宮骶韌帶PGP 9.5表達的陽性率比較采用χ2檢驗；兩組患者血清IL-10水平比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹腔鏡下兩組患者宮骶韌帶的形態學表現 對照組患者宮骶韌帶形態正常，表現為光滑的、對稱的、完整的拱形，鄰近的腹膜表面光滑（見圖1a）。實驗組患者的宮骶韌帶表現為不同程度的損傷或中斷，包括一側或兩側宮骶韌帶縮短、僵硬、消失等，覆蓋于韌帶表面的腹膜、鄰近宮骶韌帶的腹膜和輸卵管系膜表面出現新生血管（見圖 1b-d）。

2.2 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度比較 實驗組患者輸卵管黏膜層和肌層PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度較對照組明顯減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩組患者輸卵管漿膜層PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1和圖2。

2.3 兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達的陽性率比較 實驗組33例患者中，PGP 9.5陽性表達7例，PGP 9.5表達的陽性率為21.2%，在血管壁周圍可見異常增生的神經纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。對照組32例患者中，PGP 9.5陽性表達26例，PGP 9.5表達的陽性率為81.3%，兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達的陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3。

2.4 兩組患者血清IL-10水平比較 與對照組比較，實驗組患者血清IL-10水平明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 4。

圖1 腹腔鏡下兩組患者宮骶韌帶的形態學表現（a：對照組，表現為光滑的、對稱的、完整的拱形；b：兩側宮骶韌帶完全消失，類似瘢痕組織質地僵硬，腹膜表面出現新生血管；c：右側宮骶韌帶起源處中斷，兩側不對稱，子宮直腸陷凹見淡黃色的腹腔液；d：兩側宮骶韌帶稍增粗，失去正常拱形，子宮直腸陷凹見淡黃色的腹腔液，鄰近宮骶韌帶的腹膜表面出現新生血管）

表1 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5表達的陽性率及神經纖維密度比較

圖2 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5免疫反應陽性神經纖維分布情況[a：對照組患者輸卵管峽部全層（×40）；b：對照組患者輸卵管峽部黏膜層及內側肌層（×100）；c：實驗組患者輸卵管峽部全層（×40）；d：實驗組患者輸卵管峽部黏膜層及內側肌層（×100）；箭頭所指為陽性神經纖維]

圖3 兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5免疫反應陽性神經纖維分布情況[a：對照組患者宮骶韌帶(×40），表現為聚集的神經纖維束；b：對照組患者宮骶韌帶（×100）；c：實驗組患者宮骶韌帶神經纖維消失(×40）；d：實驗組患者在血管壁周圍可見異常增生的神經纖維和血管壁增厚及管腔狹窄（×40）；箭頭所指為陽性神經纖維]

3 討論

盆腔自主神經由下腹腔神經、盆腔內臟神經、盆腔神經叢及其分支構成。支配盆腔內臟的副交感神經由椎體S2～S4發出，和下腹腔神經匯合形成盆腔神經叢。盆腔神經叢走行在輸尿管與子宮動脈交叉處的下方，跨過輸尿管根部后與髂內血管伴行[5]，隨后發出兩個分支，其中一個分支與宮骶韌帶側面伴行而上，到達子宮后走行在子宮內膜－肌層之間，延伸到宮角處并支配輸卵管近端；另一個分支沿著主韌帶和子宮動脈走行，在子宮內分布于子宮漿膜層下[6]。輸卵管的遠端神經由卵巢神經跨過輸卵管系膜游離端支配[6]。困難的陰道分娩、長期的便秘、刮宮等會損傷宮骶韌帶及其上行的子宮內膜－肌層之間的神經，造成支配輸卵管神經的損傷[7-8]，與子宮腺肌病的發生、發展密切相關。

圖4 兩組患者血清IL-10水平比較（水平線代表中位數。與對照組比較，*P＜0.05）

在一項子宮腺肌病風險因素調查中，研究者發現刮宮、子宮內膜切除、剖宮產、肌瘤剔除等子宮手術使患腺肌病的風險增加（OR=1.37）[9]。子宮腺肌病患者子宮內側肌層肌纖維排列紊亂，細胞核形態不規則，提示子宮內膜-肌層交界帶存在超微結構的損傷[10]。困難的陰道分娩可能引起閉孔內側處肛提肌肌腱和下腹腔神經叢分支損傷。神經損傷后在血管壁周圍出現異常的神經再生，可能與慢性盆腔疼痛、月經紊亂、陰道和外陰疼痛以及膀胱刺激癥狀和腸道刺激癥狀密切相關[11]。研究發現慢性便秘模型大鼠結腸肌間神經叢PGP 9.5表達陽性與對照組相比明顯下降，提示發生慢性便秘時PGP 9.5表達陽性降低，可能與神經元數目減少和（或）變性有關[12]。人工流產過程中對宮頸過度牽拉，或藥物流產過程中子宮過度收縮，以及長期的便秘等可造成一側或雙側宮骶韌帶及其包含的神經出現損傷[7]。另外人工流產術中過度搔刮宮腔、吸宮時間過長、吸宮負壓過高，可造成子宮內膜基底部的損傷與子宮內膜的炎癥感染，可能會損傷子宮內膜－肌層之間的神經，導致輸卵管近端肌層處神經減少或缺失。Barcena等[13]發現子宮腺肌病患者中子宮肌層交感神經纖維密度較非腺肌病患者相比有所減少。輸卵管峽部起著“閥門”的作用，通過交感神經和副交感神經控制輸卵管峽部-壺腹部連接處，從而來調節精卵的運輸過程[14]。內異癥患者輸卵管峽部異常的神經分布，通過干擾神經遞質的釋放，影響輸卵管的蠕動功能及纖毛的擺動，可能是內異癥患者不孕的發病機制之一[15]。

有研究發現子宮腺肌病患者子宮峽子宮內膜-肌層交界處無神經分布[7]。本研究采用PGP 9.5免疫組織化學染色法對兩組患者宮骶韌帶及輸卵管峽部神經纖維做特異性染色，研究發現子宮腺肌病患者宮骶韌帶神經纖維較對照組減少，且輸卵管峽部黏膜層及肌層PGP 9.5表達明顯減少，而輸卵管漿膜層的神經分布無明顯差別。在神經嚴重損傷后，機體有修復的過程，但神經的再生往往難以調控，容易過度增生。血管受神經支配，所以在該研究中發現在血管壁周圍可見異常增生的神經纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。與本次研究相符，有學者發現部分子宮腺肌病患者病灶邊緣可以觀察到小直徑神經纖維局部增殖，提示該病灶處的神經纖維在損傷后有再生的可能[7]，這也可能是引起慢性盆腔疼痛、痛經、性交痛及不孕等臨床癥狀的原因[16]。

神經損傷后會分泌多種細胞因子如IL-10、IL-6、激肽蛋白B、神經生長因子等促進自我修復[17]。IL-10是主要的抗炎細胞因子之一，屬于細胞因子中的干擾素家族，抑制中性粒細胞中炎性介質的產生。它是由活化的巨噬細胞、B細胞、T細胞等分泌的一種具有多種生物活性的Th2型細胞因子，可拮抗Th1型細胞應答及其細胞因子的產生，是一種公認的介導免疫抑制的細胞因子[4，18]，研究發現腺肌病患者在位內膜及異位內膜上皮細胞中，IL-10的表達顯著升高，認為IL-10通過免疫抑制機制使異位病灶在腹腔或子宮肌層中逃避機體免疫攻擊，使得異位病灶不能及時被清除，從而持續生長，形成了子宮內膜異位癥[4，18]。Weiss等[19]研究發現與對照組相比，內異癥患者腹腔液中IL-10的表達明顯增高并且參與了免疫調節。Suen等[20]研究發現IL-10水平在內異癥患者血清中明顯升高，子宮內局部IL-10高表達促進內異癥小鼠模型中異位病灶生長。與該研究相符，本研究發現子宮腺肌病患者血清IL-10較非腺肌病患者顯著增加。Carrarelli等[21]研究發現子宮腺肌病病灶中炎癥因子IL-1β、促腎上腺皮質激素釋放激素、尿促皮素mRNA表達增加，神經因子異常表達與炎癥相互作用可能是子宮腺肌病發病機制之一。另Li等[22]研究發現炎癥、神經生長因子、血管的生成可能與腺肌病小鼠模型中子宮內異常的神經分布相關。內異病灶和神經之間的相互作用可能是通過炎癥介導，一系列炎癥反應與感覺神經相互作用，可能會增加外周神經的敏感性，并在內異癥相關疼痛中起到重要作用[23]。神經損傷與炎癥相互作用，促進子宮腺肌病的發生、發展。

綜上所述，人工流產、刮宮、困難的陰道分娩、長期的便秘等會損傷宮骶韌帶及其上行的子宮內膜－肌層之間的神經，造成支配輸卵管神經的損傷。子宮腺肌病患者血清IL-10顯著升高，盆腔神經損傷與血清IL-10相互作用可能與子宮腺肌病的發生、發展相關。

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Injury of pelvic nerves and serum level of IL-10 in patients with adenomyosis

CAI Yaoyao, XU Xinxin, WU Xueqing.
Departments of Gynecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325015,China

Objective To investigate the damage of pelvic nerves and the serum levels of IL-10 in patients with adenomyosis. Methods Histological sections of the uterosacral ligaments and the isthmus of fallopian tubes were obtained from women undergoing hysterectomy for adenomyosis(adenomyosis group,n=33)and leiomyoma or cervical intraepithelial neoplasia III(CIN III)(non-adenomyosis group,n=32).The expression ofprotein gene product 9.5(PGP 9.5)in uterosacral ligaments and the isthmus offallopian tube was immunohistochemically analyzed.The distribution ofnerve fibers in the uterosacral ligaments and the isthmus of fallopian tube was examined microscopically.Serum IL-10 levels were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)in two groups. Results Varying degrees of injuries and interruptions of the uterosacral ligaments were noted in the adenomyosis patients and there was strong evidence of neovascularization of the peritoneal surfaces over the ligament,adjacent peritoneum and mesosalpinx.The expression of PGP 9.5 and the density of nerve fibers in the mucosal and muscular layers of fallopian tubes were significantly decreased in adenomyosis(all P＜0.05).The nerve fibers stained with PGP 9.5 in the serous layer ofthe fallopian tube among the two groups showed no significant difference(both P＞0.05).The nerve fibers were decreased in the uterosacral ligaments of adenomyosis group compared with non-adenomyosis group(P＜0.05).The abnormal hyperplasia of the nerves was observed and the surrounded injured arterioles had thickened vessel walls and narrowed vascular cavity in adenomyosis group.The level of serum IL-10 in patients with adenomyosis was significantly higher than that in non-adenomyosis patients(P＜0.05). Conclusion Varying degrees of injuries to the nerves in the uterosacral ligaments and in the mucosal and muscular layers of fallopian tubes are noted in the adenomyosis patients.There is significantly abnormal serum IL-10 in patients with adenomyosis,which indicates that the interaction between pelvic nerve injury and inflammation may be responsible for the disease development.The results may provide a novelinsight into the pathogenesis ofadenomyosis.

Adenomyosis UterosacralligamentNerve fibers Injured nerve IL-10

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.21.2017-548

溫州市公益性科技計劃項目（Y20140743）

325015 溫州醫科大學附屬第一醫院婦產科

吳雪清，E-mail：wuxueqing.37@hotmail.com

2017-03-14）

陳麗）