穴位埋線對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)p53蛋白表達的影響

李 霞 唐中生 吳春朋 謝高宇 陸 瑩 羅亞非

(貴陽護理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)護理教研室,貴州 貴陽 550081)

穴位埋線對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)p53蛋白表達的影響

李 霞 唐中生1吳春朋1謝高宇1陸 瑩1羅亞非1

(貴陽護理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)護理教研室,貴州 貴陽 550081)

目的觀察穴位埋線對血管性癡呆(VD)大鼠海馬CA1區(qū)p53蛋白表達的影響。方法取SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組、尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法(4-VO)建立VD大鼠模型，兩個治療組分別施行穴位埋線和尼莫地平治療，連續(xù)15 d。水迷宮行為學(xué)測試后，斷頭處死大鼠，采集海馬CA1區(qū)，用免疫組織化學(xué)法檢測其p53表達，并取大腦皮質(zhì)做冠狀位病理切片進行HE染色，觀察并比較各組大鼠海馬CA1區(qū)p53和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷程度。結(jié)果假手術(shù)組海馬CA1區(qū)未見p53陽性細胞，穴位埋線組及尼莫地平組海馬CA1區(qū)p53陽性細胞平均灰度值均明顯高于VD模型組(Plt;0.05)，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷和變性減輕且數(shù)量增加。結(jié)論穴位埋線可明顯降低海馬CA1區(qū)p53蛋白的表達，抑制VD大鼠腦損傷引起的細胞凋亡，對腦組織起保護作用，這可能是其治療VD的作用機制之一。

穴位埋線；血管性癡呆；p53；海馬

血管性癡呆(VD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征，為一慢性進行性疾病〔1〕。 針灸治療VD療效肯定，副作用少，可明顯減輕癡呆癥狀、改善學(xué)習(xí)和記憶〔2,3〕。作為針灸療法的分支，穴位埋線療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各科〔4〕。研究表明〔5〕，穴位埋線可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在此基礎(chǔ)上，我們制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，探討VD發(fā)病與海馬CA1區(qū)p53蛋白表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2實驗器材 可吸收性外科縫線(經(jīng)絡(luò)疏通專用線，中國中醫(yī)研究院眾益科技開發(fā)公司)；華佗牌1.5寸毫針(蘇州醫(yī)療器械廠)；電子天平(巨天儀器設(shè)備有限公司，ES200)；微型動脈夾(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術(shù)器械廠)。

1.3藥品與試劑 10%水合氯醛(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；尼莫地平片(正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：0801002)；4%多聚甲醛、p53免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4VD大鼠模型的建立 采用改良Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立VD大鼠模型〔6〕。按隨機數(shù)字表法將已經(jīng)制備成功的VD模型大鼠分為VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，除去治療過程中死亡的大鼠，保證每組至少10只。另設(shè)假手術(shù)組10只作對照，處理步驟同上，但不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。四個組的治療時間和治療方法按課題組之前的方法進行〔5〕。

1.5標(biāo)本制作及檢測 用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，迅速開胸暴露心；經(jīng)升主動脈插管后，先用100 ml生理鹽水快速沖洗，隨后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)灌流約1 h；灌注完畢后迅速開顱取出完整大腦,剝離腦膜,用鑷子從矢狀縫將皮質(zhì)向兩邊分,先取海馬放入4%多聚甲醛固定，依次酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，進行p53免疫組織化學(xué)染色〔二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色〕。后取額葉部大腦皮質(zhì)，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，進行HE染色。

1.6p53蛋白圖像分析 p53陽性細胞主要表達于細胞核，著色呈棕黃色。運用圖像分析系統(tǒng)測定各組海馬CA1區(qū)p53蛋白陽性反應(yīng)物的平均灰度值(平均灰度值0～255，其值越大，表達水平越低)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元病理學(xué)觀察 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞排列緊密，細胞邊緣清晰，未見神經(jīng)元變性和壞死，胞質(zhì)染色均勻，核圓而大，核仁、核膜清晰，有輕微水腫和神經(jīng)元腫脹，無膠質(zhì)細胞增生和淋巴細胞浸潤。VD模型組大腦皮質(zhì)局部出現(xiàn)水腫，神經(jīng)元中度腫脹、變性和壞死，體積增大，細胞稀疏，細胞質(zhì)染色變淺及尼氏體消失，細胞核體積增大，染色變淺，膠質(zhì)細胞增生形成結(jié)節(jié)，無淋巴細胞浸潤。穴位埋線組大腦皮質(zhì)見輕微組織水腫和神經(jīng)元腫脹，神經(jīng)元無變性和壞死，無膠質(zhì)細胞增生和淋巴細胞浸潤。尼莫地平組大腦皮質(zhì)水腫明顯減輕，神經(jīng)元輕微腫脹，神經(jīng)元輕度變性和壞死，核固縮現(xiàn)象減輕，膠質(zhì)細胞輕度增生。見圖1。

2.2各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p53表達 見圖2。假手術(shù)組未

圖1 各組大腦皮質(zhì)冠狀切片(HE，×400)

圖2 各組海馬CA1區(qū)p53陽性表達(DAB，×400)

見p53陽性細胞，其平均灰度值(191.39±5.13)，是其背景的非特異性反應(yīng)；其余各組均可見p53陽性細胞，鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要表達于細胞核，少量表達于胞質(zhì)。VD模型組平均灰度值(144．28±10．33)，穴位埋線組(186.21±2.25)，尼莫地平組(177.12±2.06)。VD模型組平均灰度值明顯低于假手術(shù)組(Plt;0.01)；與VD模型組平均灰度值比較，穴位埋線組明顯增設(shè) (Plt;0.05)，穴位埋線組平均灰度值與尼莫地平組無明顯差異(Pgt;0.05)。

3 討 論

研究認(rèn)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡可能是VD重要的發(fā)病機制和病理基礎(chǔ)〔7〕。p53是一種促凋亡基因，在正常組織中的表達極低，p53及其相關(guān)基因在腦缺血中的表達與調(diào)控，是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，腦損傷可導(dǎo)致p53的表達增加〔8〕，抑制p53的表達對腦缺血組織具有保護作用〔9〕。p53還能減少Bcl-2蛋白的表達，增強Bax蛋白表達，并調(diào)節(jié)Bax、caspase等系列下游基因而促進神經(jīng)細胞凋亡〔10〕，表明p53基因具有促進神經(jīng)細胞凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白表達增加參與了大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞的DNA斷裂〔11〕，在腦創(chuàng)傷后的大鼠海馬區(qū)凋亡的神經(jīng)細胞中檢測到p53 mRNA〔12〕。Martin等〔13〕也認(rèn)為大鼠腦創(chuàng)傷后p53蛋白表達增加，可能通過調(diào)整Bax蛋白表達促進神經(jīng)細胞凋亡。本文結(jié)果提示穴位埋線治療后大鼠p53蛋白表達明顯下降。穴位埋線是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，將可吸收性外科縫線置入穴位內(nèi)，利用線對穴位產(chǎn)生的持續(xù)性刺激作用以防治疾病的方法〔14〕。中醫(yī)認(rèn)為，氣行則血行，血行則髓生，氣血調(diào)和，百病不生。癡呆患者多屬本虛標(biāo)實，氣滯血瘀。取百會、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方，探索穴位埋線對缺血性腦血管病的作用機制，五穴組合，共奏益氣活血之功。關(guān)建軍等〔15〕研究表明，針灸益氣活血法可明顯改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低海馬真性膽堿酯酶(T-chE)含量，可顯著提高VD大鼠大腦皮質(zhì)CA1區(qū)的突觸數(shù)密度和突觸活性區(qū)的面積密度〔16〕，還可提高VD大鼠海馬組織中SOD活性及降低MDA含量〔17〕。本文結(jié)果提示穴位埋線通過下調(diào)VD大鼠海馬CA1區(qū)p53蛋白的表達，抑制了VD大鼠腦損傷引起的細胞凋亡，對VD大鼠腦組織起到了保護作用，這可能是其治療VD的作用機制之一。

1Wahlund LET，Gauthier S.Vascular cognitive impairment in clinical practice〔M〕.Cambridge,UK：Cambridge University Press,2009:301-10.

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3羅梅桂，羅本華.針灸治療血管性癡呆的機理研究進展〔J〕.廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014;17(4)：97-9.

4蒙 珊,呂計寶,文小江.穴位埋線療法臨床應(yīng)用近況〔J〕.山西中醫(yī),2012;28(2):56-8.

5唐中生，謝高宇，陸 瑩，等.穴位埋線對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血清白介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014;34(22)：6407-9.

6李文東，姜洪波，連曉倩，等.Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改進〔J〕.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010;27(3):237-9.

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14中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會GB/T 21709.10-2008針灸技術(shù)操作規(guī)范 10部分穴位埋線〔S〕.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：1-7.

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17姬軍風(fēng)，關(guān)建軍，吳世衛(wèi).針灸益氣活血法對血管性癡呆大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影響〔J〕.河北中醫(yī)，2011;33(10):1554-6.

〔2016-09-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R743

A

1005-9202(2017)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.008

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(No.黔教科2010050)

1 貴陽中醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室

唐中生(1977-)，男，碩士，教授，主要從事腦血管病學(xué)研究。

李 霞(1978-)，女，講師，主要從事老年護理教育教學(xué)研究。