枸杞果酒用非釀酒酵母的分離篩選及香氣成分分析

劇檸，趙梅梅，柯媛，陳玲，趙智慧，馬艷

1(寧夏大學 農學院，寧夏回族自治區銀川，750021) 2(寧夏紅枸杞產業集團有限公司，寧夏回族自治區銀川，750000)

枸杞果酒用非釀酒酵母的分離篩選及香氣成分分析

劇檸1,2 *，趙梅梅1，柯媛2，陳玲2，趙智慧2，馬艷2

1(寧夏大學 農學院，寧夏回族自治區銀川，750021) 2(寧夏紅枸杞產業集團有限公司，寧夏回族自治區銀川，750000)

研究顯示非釀酒酵母在果酒發酵前期可產生更多的香氣成分，有助于果酒風味的提高。為獲得適合枸杞果酒發酵的非釀酒酵母，從枸杞果園土壤、枸杞鮮果及枸杞果自然發酵液中分離出酵母82株。經香氣初步篩選及耐受性研究，確定3株酵母各方面性能良好。經26S rDNA序列分析，確定GF-60和GF-80為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，GB-1為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。將GF-60與商用釀酒酵母以3∶1比例進行混合發酵枸杞果酒，經GC-MS測定分析，結果顯示與釀酒酵母單獨發酵相比，混種發酵含有更多種類的香氣成分。

非釀酒酵母；耐受性；枸杞果酒；香氣成分

枸杞含有豐富的營養成分及生物活性物質，具有增強人體免疫力, 以及抗衰老、防腫瘤等功效，被國家列為藥食同源物品[1-3]。枸杞果酒是以寧夏枸杞果為原料，經酵母菌發酵制成的低度酒，較完整的保留了枸杞的主要營養成分[4-5]。近年來，隨著人們對果酒接受度的提高，枸杞發酵果酒也越來越被大眾所歡迎。然而，目前生產枸杞果酒使用的酵母多為葡萄酒專用的釀酒酵母。該類酵母具有較強的發酵能力，但產生香氣的能力不足。此外，與其他果酒生產不同，考慮到季節性因素，枸杞果酒中生產中常使用枸杞干果復水的方法進行發酵；同時為去除表面農藥殘留，生產中枸杞原料發酵前需進行清洗，這使得大量枸杞果表面的非釀酒酵母被除去，發酵前期非釀酒酵母的作用無法得以發揮。因此，枸杞果酒存在著果香不突出、典型性欠佳的缺陷，影響了枸杞果酒的品質及銷量。

大量研究表明，非釀酒酵母在葡萄酒釀制過程中，通過與釀酒酵母的共同發酵來控制酒體不理想的風味或者降低乙醇含量來賦予葡萄酒復雜的香氣，從而增加葡萄酒感官質量特征的復雜性[6-8]。這些非釀酒酵母包括美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)[9]、戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[10]、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)[6]、嗜高壓有孢漢遜酵母(Hanseniasporaosmophila)[11]、檸檬形克勒克酵母(Klockeraapiculata)[12]、德巴利酵母(Debaryomycesvanriji)[13]及葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)[14]等。 這些酵母在發酵過程中可產生一些高級醇、低級脂肪酸和酯類等芳香化合物，使得果酒的氣味芬芳，酒體典型性更加突出。

為此，本項目從枸杞果表面、枸杞果園土壤及枸杞自然發酵醪液中分離出非釀酒酵母菌，經過感官評價及耐受性篩選獲得性能較為優良的酵母，通過26S rDNA序列分析進行菌種鑒定確定其歸屬，并對其與釀酒酵母混種發酵的枸杞酒香氣成分進行分析，從而篩選出能夠改善枸杞酒香氣的酵母菌。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品采集

針對不同時節、不同樹齡、不同從枸杞樹品種的果園土壤、枸杞鮮果進行采樣。樣品無菌采集后送至實驗室。

1.1.2 培養基與溶液配制方法

YPD(酵母膏胨葡萄糖)培養基：按葡萄糖2.0 %，蛋白胨2.0 %，酵母浸粉1.0 %，蒸餾水配置，自然pH值，121 ℃高壓滅菌20 min；固體培養基則加入2.0 %瓊脂粉。

PDA培養基：土豆去皮洗凈，稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用雙層紗布過濾，加熱，再據實際實驗需要加1～10 g瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后在補足水分至1 000 mL，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存備用。

1.1.3 菌種及主要儀器

釀酒酵母AC(Saccharomycescerecisiae522 Davis)，由法國Laffort公司生產；日本島津GCMS-TQ8040三重四極桿型氣相色譜質譜聯用儀；美國supelco 公司手動固相微萃取(SPME)裝置。

1.2方法

1.2.1 酵母菌的分離

(1)土壤及枸杞果表面的分離

① 增菌：取5.0 g樣品于45 mL YPD液體培養基中，28 ℃、200 r/min搖瓶培養24～48 h或更長時間，直至液體培養基變渾濁，鏡檢有活菌存在后進一步分離純化。

② 計數：將經過增菌的液體進行10倍梯度稀釋，并分別吸取0.1 mL均勻涂布于加有30 mg/L亞硫酸鈉(以抑制細菌生長)的YPD培養基平板上，28 ℃培養48 h。

③ 分離：選取2天后生長于YPD培養基上的單個菌落，根據菌落形態特征及鏡檢結果，挑取單菌落于PDA培養基上劃線培養分純。

(2)枸杞自然發酵液中酵母菌的分離

① 自然發酵：無菌狀態下稱量約100 g新鮮成熟度好的枸杞，放入無菌的500 mL錐形瓶中，用無菌的研錘搗碎，用封口膜封好，置于28 ℃培養，每2 h觀察1次。

② 計數：在發酵前、中、后3個時期，分別提取汁液進行10倍梯度稀釋，取0.1 mL樣品稀釋液均勻涂布于酸化PDA培養基上，28 ℃ 培養48 h。

③ 分離：同1.2.1(1)。

(3) 保藏

鏡檢為純種后進行4 ℃斜面保藏，每隔3個月轉接1次；同時進行甘油-40 ℃菌種長期保藏。

1.2.2 產香酵母的篩選

將分離菌株劃線接種于YPD 平板上， 28 ℃培養 3～5 d，通過嗅聞法[15]初步判斷是否有酯香或醇香，篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。將初篩獲得的酵母菌接種于枸杞汁培養基中， 28 ℃活化培養24 h后，以4.0 %接種量接種于裝有200 mL枸杞汁的三角瓶中，28 ℃培養 3～5 d，再次通過嗅聞法[15]判定具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。

1.2.3 產香酵母的耐受性研究

制備不同初始葡萄糖濃度、不同pH、不同SO2質量分數及不同乙醇體積分數的滅菌YPD液體培養基，按4.0 % 的接種量接種， 28 ℃培養48 ～72 h觀察并記錄結果。其中，乙醇耐受實驗結果需通過分光光度計在560 nm下檢測OD值獲得。同時將相同接種量的枸杞汁培養基在不同溫度下培養48 h ，觀察并記錄其產期情況。

1.2.4 26S rDNA基因序列測定及系統發育樹分析

分離的酵母菌純種送基因公司測序，將測序后結果在NCBI上進行BLAST比對，篩選相似度高的18序列，采用Neighbor-Joining(NJ)法構建系統發育樹，使用Clustal X軟件進行序列比對，MEGA 5.05繪制系統發育樹。

1.2.5 枸杞果酒的釀制及操作要點

圖1 枸杞果酒發酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of wolfberry wine

操作要點：

(1)干果復水：干枸杞和水按照質量比為1∶10的比例進行混合復水。

(2)浸提：將復水好的液體煮沸30 min，冷卻后留清汁備用。

(3)預處理：30～40 ℃下，添加30 mg/kg果膠酶和50 mg/kg果汁復合酶進行酶解。酶解后的枸杞汁，添加40 mg/kg SO2處理。

(4)調整成分：在枸杞汁中添加檸檬酸至酸度值為3 g/L；同時，為使目標酒精體積分數在8.0 %～10.0 %，在發酵前期及發酵中進行分批次補加白砂糖。

(5)酵母活化：將酵母菌分別接種于干果復水的枸杞汁培養基中活化。枸杞汁培養基按1.2.5(1)操作。

(6)發酵：采取清汁發酵的方式，發酵溫度設為20 ℃。分別發酵兩種酒，一種為單獨接種釀酒酵母AC，另一種為葡萄汁有孢漢遜酵母GF-60與釀酒酵母AC以3∶1的比例同時接種發酵。接種量按體積分數8%接種。

(7)分離：當比重達0.992～0.996，殘糖低于4 g/L時發酵結束，采用虹吸法進行分離。

(8)澄清過濾：抽濾機進行精濾。

(9)理化檢測：測定揮發酸、殘糖、酒度、總酸、游離SO2、總SO2。

1.2.6 香氣成分分析

(1)揮發性化合物的萃取

利用手動頂空固相微萃取(HS-SPME)法對枸杞酒樣品中揮發性物質進行富集，取20 mL頂空瓶，用無菌移液管加8 mL于40 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，插入CAR/DVB/PDMS纖維頭40 ℃吸附15 min，GC解吸3 min，用于GC-MS分析。

(2)氣相色譜質譜工作條件

色譜條件為：色譜柱為RTX-WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm )，程序升溫：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升至180 ℃，再以8 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min。載氣為He，體積流量為1.40 mL/min，進樣口溫度為210 ℃。質譜條件為：EI 電離源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA。檢測器電壓為350 V。掃描范圍為20～450 AMU，離子源溫度為200 ℃。

對采集到的質譜圖利用NIST 02譜庫進行檢索。

2 結果與討論

2.1產香酵母的分離及初篩結果

通過分離純化共獲得純種酵母菌82株。其中6株分離自土壤，13株分離自枸杞果表面，63株分離枸杞自然發酵液的不同時期(發酵前期9株，中期48株，后期4株)。

通過嗅聞法初篩后獲得24株酵母菌，進一步接入枸杞汁發酵后篩選出9株果香和酒香味較濃的酵母菌，分別為GB-1、GB-21、GB-23、GB-26、GB-40、GF-60、GF-65、GF-85、和GG-8。

2.2產香酵母的對葡萄糖的耐受性

針對上述9株產香酵母進行葡萄糖、pH、SO2及溫度耐受性實驗，實驗結果見表1。從表1的結果可知，菌GB-1、GB-26、GB-40和GF-85在對糖的耐受性最好，在100～400 g/L的糖質量濃度下，24 h內生長旺盛。GG-8可耐受100 g/L的糖，24 h內生長旺盛；延長培養時間至48 h，GG-8在100～400 g/L 的糖質量濃度下可生長，且生長旺盛。GB-21和GF-60可在100～400 g/L 的糖濃度下生長，48 h后生長達到旺盛。100～400 g/L 的糖質量濃度下，GF-23和GF-60在24 h內未生長，然而在48 h后觀察這2株菌可耐受在100～300 g/L 的糖質量濃度，且生長良好。GF-65在100～400 g/L的糖質量濃度下均無法生長。

表1 不同酵母菌糖耐量實驗結果

注：“+++++”表示氣體充滿整個杜氏管，“++++”表示氣體充滿杜氏管4/5，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/5，“++”表示氣體充滿杜氏管2/5，“+”表示氣體充滿杜氏管1/5，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/5，“--”表示未起酵。

2.3產香酵母的對SO2的耐受性

表2給出了菌株耐受SO2的情況。所有供試的9菌株耐受SO2的能力都很強。其中GB-1，GB-21，GB-23，GB-26和GB-40在24 h內即可在含100～250 mg/L SO2的培養基中旺盛生長。GF-60、GF-65、GF-85和GG-8在24 h內即可在含100～250 mg/L SO2的培養基中生長，48 h后生長達到旺盛。

2.4產香酵母的對乙醇的耐受性

酵母菌OD值越大，則表示該酵母菌生長越旺盛，即對該濃度乙醇的耐受性越強。因此，根據 OD 值測定結果，以酵母菌 OD 生長值的平均值為標準，將各類酵母菌生長情況設定為4個等級，即I不生長(0lt;ODlt;0.03)，II生長(0.05lt;ODlt;0.09)，III良好生長(0.150lt;ODlt;0.200)，IV旺盛生長(ODgt;0.200)，生長結果見表3。

表2 不同酵母耐SO2實驗結果

注：“+++++”表示氣體充滿整個杜氏管，“++++”表示氣體充滿杜氏管4/5，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/5，“++”表示氣體充滿杜氏管2/5，“+”表示氣體充滿杜氏管1/5，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/5，“--”表示未起酵。

從結果可以看出，GB-1和GF-60耐受乙醇的能力最強，即使在14%的乙醇體積分數下，24 h內依然可以旺盛生長。其次為GB-21、GF-65和GF-85，在12%的乙醇濃度下，24 h內依然可以旺盛生長。GF-40雖然生長不旺盛，但在10%～14%的乙醇體積分數下均可得以生長。其余菌株，GB-21、GB-23、GB-26、GG-8在10%～12%的乙醇下均可得以生長，不能耐受14%的乙醇。

表3 不同酵母耐受乙醇實驗結果

2.5產香酵母的對溫度的耐受性

表4給出了9株酵母對溫度的耐受性。除GB-23、GF-60和GF-65在40 ℃下不生長外，所有菌株都可在10～40 ℃的范圍內生長。GB-1在果酒常用的低溫發酵的范圍(15～20 ℃)24 h內即可達到旺盛生長。此外，GB-21、GB-23、GB-40、GF-65和GF-85在15～20℃的范圍內，36 h產氣充滿杜氏管，說明生長旺盛。

2.6優良產香酵母的分子生物學鑒定結果

研究顯示，非釀酒酵母在果酒發酵的前期發酵可以產生更多的香氣成分，因此其發酵前期菌種本身的特性非常重要。根據耐受性結果，菌株GB-1，GF-85，GF-60性能較為優良。對該3株菌進行26S rDNA基因序列測定并構建系統發育樹，結果見圖 2。根據菌體形態、菌落形態特征以及序列對比分析，菌株GF-85與GF-60鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，菌株GB-1鑒定為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。

表4 不同溫度下酵母菌的生長情況

注：“++++”表示氣體充滿整個杜氏管，“+++”表示氣體充滿杜氏管3/4“++”表示氣體充滿杜氏管2/4，“+”表示氣體充滿杜氏管1/4，“-”表示氣體充滿杜氏管lt;1/4，“--”表示未起酵。

圖2 基于26S rRNA D1 /D2 區域序列構建的酵母菌菌株系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence analyses

2.7香氣成分分析

采用釀酒酵母AC單獨發酵及GF-60與AC以3∶1的方式進行混合發酵生產枸杞發酵果酒，發酵結束后采用GC-MS對其中的揮發性成分進行分析比較。總離子流圖見圖3，圖4。

所檢測到的質譜數據經過NIST標準譜庫檢索后，獲得不同樣品揮發性化合物的種類及相對含量見表5。實驗共檢測出揮發性化合物46種，其中酯類25種、醇類8種、烷烴類6種、酮類2種、酸類2種、烯烴類1種、醛類1種。與釀酒酵母AC單獨發酵的枸杞酒樣相比，葡萄汁有孢漢遜酵母GF-60與釀酒酵母AC混合發酵枸杞酒所檢出的香氣成分更為復雜。

圖3 釀酒酵母AC單獨發酵枸杞果酒的GC-MS總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of wolfberry wines with Saccharomyces cerecisiae AC fermentation

圖4 葡萄汁有孢酵母GF-60與釀酒酵母AC(3∶1)混種發酵枸杞果酒的GC-MS總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms of wolfberry wines with Hanseniaspora uvarum GF-60 and Saccharomyces cerecisiae AC mixed fermentation (3∶1)

酯類物質是構成枸杞酒香氣的主要成分。混合發酵所檢測到的酯類物質無論從種類(20種)還是含量(31.58%)均遠遠超出了釀酒酵母單獨發酵時酒樣中酯類種類(13種)及含量(15.14%)。且混合發酵產生的主要的酯類物質辛酸乙酯(13.00%)和癸酸乙酯(8.36%)均高于釀酒酵母單獨發酵所產生的辛酸乙酯(9.21%)和癸酸乙酯(2.33%)。其中辛酸乙酯具有白蘭地酒香氣，癸酸乙酯具有果香和花香的香氣。此外，混合發酵還檢出多種單獨發酵未檢出的酯類，這些酯類物質大多具有花香和果香氣，雖然含量很低，但較低的閾值使得混合發酵枸杞果酒具有比釀酒酵母單獨發酵更為豐富的香氣。因此，混合發酵的枸杞果酒具有更加濃郁的花香和果香味。

表5 兩種枸杞果酒的主要香氣成分

除酯類物質外，醇類物質也是枸杞酒揮發性成分的重要組成部分。混合發酵所檢測到的醇類物質種類(7種)和含量(35.41%)低于釀酒酵母單獨發酵的種類(8種)及含量(71.42%)。其中，枸杞果酒種主要的醇類物質1,3-丁二醇在混合發酵枸杞酒中含量(24.94%)遠遠低于釀酒酵母單獨發酵的酒體(51.49%)。異戊醇是枸杞果酒種另一種主要醇類，同樣其在混合發酵枸杞酒中的含量(7.95%)低于釀酒酵母單獨發酵的酒體(13.10%)。1,3-丁二醇略有苦甜味，異戊醇具有酒香和果香的味道。因此，混合發酵酒體的苦味沒有釀酒酵母單獨發酵時的明顯。

烷烴類化合物相對含量較低且烷烴香味閾值較高，對風味物質的直接貢獻不大，但其可能是形成雜環化合物的重要中間體，有助于提高酒體的整體風味。

4-羥基-2-丁酮具有芳香氣味，混合發酵酒樣中相對含量為10.18%，而AC發酵酒樣未檢出。檢出的另一物質，3-羥基2-丁酮具有令人愉快的奶香氣，其在混合發酵酒樣中的相對含量略高于單獨發酵酒樣。

此外，GF-60的混合發酵樣品中還檢測到乙酸和4-羥基-丁酸兩種酸類，癸醛一種醛類，這些物質雖然含量低，但都對復雜的香氣做出了貢獻。

3 結論

從枸杞果園土壤、枸杞鮮果及枸杞自然發酵液中分離出酵母82株。經感官初篩獲得9株果香和酒香味較濃的酵母菌。經葡萄糖耐受性、SO2耐受性、乙醇耐受性、溫度耐受性實驗，確定GF-60和GF-80和GB-1各方面性能良好。經26S rDNA序列分析，確定菌GF-60和GF-80為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，GB-1為戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。將GF-60與商用釀酒酵母以3∶1進行混合發酵枸杞果酒，經GC-MS測定分析，結果顯示與釀酒酵母單獨發酵相比，混種發酵含有更多種類的香氣成分；與釀酒酵母單獨發酵相比，具有更加復雜的花香與果香氣，原有苦味減弱，有助于提高改善枸杞酒的風味。

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Isolation,screeningandanalysisofaromacomponentsofnon-Saccharomycesforwolfberrywine

JU Ning1,2*, ZHAO Mei-mei1, KE Yuan2, CHEN Ling2, ZHAO Zhi-hui2, MA Yan2

1 (School of Agriculture Ningxia University, Yinchuan 750021, China) 2 (Ningxia Hong Gouqi Industry Group Co., Ltd, Yinchuan 750000, China)

Studies have shown that nonSaccharomycescan produce more aroma components at the pre- fermentation stage of fruit wine, which contributes to the improvement of wine flavor. In order to obtain the non-Saccharomycessuitable for wolfberry wine, 82 strains of yeast were isolated from wolfberry orchard soil, fresh fruit of wolfberry and naturally fermented wolfberry liquid. 3 strains showed good performance in aroma and tolerance after preliminary screening and tolerance study. By the analysis of 26S rDNA sequence, GF-60 and GF-85 were identified asHanseniasporauvarum, GB-1 was identified asTorulasporadelbrueckii. Through GC-MS analysis, the wolfberry wine fermented by GF-60 and commercial yeast (ratio 3∶1) produced more kinds of aroma components than which was fermented only by commercial yeast.

non-Saccharomyces; tolerance; wolfberry wine; aroma components

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014953

博士，副教授(本文通訊作者,E-mail:juning1122@163.com。第1、第2單位對本文具有同等作用)。

中央財政支持地方高校改革發展資金項目(2017)

2017-06-13，改回日期：2017-08-05