超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜篩查水果罐頭中37種食品添加劑

王駿，宿書芳，胡梅，徐大瑋，祝建華

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜篩查水果罐頭中37種食品添加劑

王駿*，宿書芳，胡梅，徐大瑋，祝建華

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜篩查水果罐頭中37種食品添加劑的方法。試樣用乙腈-水提取，以乙腈-乙酸銨溶液為流動相，在Acquity UPLC BEH C18色譜柱上進行分離，電噴霧電離源負離子模式下采用全信息串聯質譜信息采集的模式檢測，通過各化合物的分子離子和特征碎片離子結合保留時間定性，外標法定量。結果表明，方法定量限為0.02～0.5 mg/kg，在0.5～50 μg/mL內線性關系良好(r≥0.99)，所有添加劑的回收率為79.5%～103.5%。該方法快速、靈敏、準確，適用于罐頭中37種食品添加劑的快速篩查。

超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜；食品添加劑；篩查；水果罐頭

水果罐頭中常用的食品添加劑主要是防腐劑、甜味劑和合成色素。超范圍、超限量使用這些食品添加劑可能對消費者健康造成損害。目前食品添加劑的定量檢測方法主要有：薄層色譜法[1]、液相色譜法[2-10]、氣相色譜-質譜法[11-15]、液相色譜-質譜法[16-20]等，這些方法多針對一種或幾種添加劑，還不能實現多種不同類別食品添加劑的同時測定。液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術近年來日趨成熟[21-23]，通過飛行時間質譜測定目標物和其碎片離子的精確質量數，可實現對多種食品添加劑的快速準確篩查。四極桿飛行時間質譜作為一種高分辨技術，能夠獲得樣品的全掃描質譜圖，質量測定的精度越高，理論上越可以減少可能的目標化合物數量，從而增強對目標化合物確認的可信度。對于多種食品添加劑的快速篩查分析，這種技術非常有效。本文應用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術，測定了水果罐頭中37種食品添加劑，探索了同時使用分子離子、特征碎片離子和保留時間作為定性篩查依據，對多種、多類食品添加劑進行高通量篩查的新方法。

1 實驗部分

1.1材料與儀器

1.1.1 試劑

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅、靛藍、新紅和誘惑紅：均購自中國國家標準物質中心；對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、納他霉素、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、喹啉黃、酸性紅52、酸性紅92、酸性黃17、橙黃Ⅱ、偶氮玉紅、酸性紅13、麗春紅3R、萘酚黃、食用綠色2號、孟加拉紅、酸性紅14、專利藍、亮黑，均購自德國Dr.公司，純度83%～99%。乙腈(色譜純，Fisher公司，美國)，乙酸銨(純度gt;99%，Sigma公司，美國)，實驗用水為超純水機(Millipore公司，美國)現制備。0.22μm有機相微孔濾膜。

1.1.2 儀器

AcquityRUPLCR型超高效液相色譜儀，由二元泵、柱溫箱、自動進樣器組成，美國Waters公司。XEVO QTOF型四極桿飛行時間質譜儀，配電噴霧電離源(ESI)，帶有Masslynx 4.1及Chromlynx和Targelynx軟件，美國Waters公司。

1.2樣品處理

水果罐頭充分粉碎、混勻后，稱取5 g于25 mL比色管中，加超純水15 mL，置于60 ℃水浴中加熱5 min，振搖使樣品充分分散、混勻。用氨水(1+1)溶液調至中性，劇烈振搖，40 ℃超聲15 min，取出冷至室溫后用乙腈定容并搖勻，經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后待測。

1.3色譜質譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為AcquityRUPLCRBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司)，流動相A為乙腈，流動相B為10 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序為0～2 min，由2%A線性增加至10%A；2～7 min線性增加至40%A，7～8 min線性增至90%A，8.1 min變為2%A，流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.2 質譜調諧參數及篩查方法

電噴霧電離負離子模式，毛細管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，提取錐孔電壓4 V；源溫120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量50 L/h。采用MSE方式進行數據采集，低能通道的碰撞能量為12 eV，高能通道碰撞能量為15～30 eV，質量掃描范圍50～1 000。使用亮氨酸腦啡汰作為質量鎖定(Lockmass)的化合物，在負離子模式下，Lockmass的理論參考值為554.261 5。質譜采集過程中，每隔30 s采集一次Lockmass，取每2次采集的Lockmass測定平均值，用于校正此段時間內采集的質荷比的精度，確保所有篩查數據的質量偏差在3×10-6以內。

2 結果與討論

2.1分析前樣品的處理

因為篩查的對象涉及多種食品添加劑，前處理必須兼顧絕大多數組分的提取效率。考慮到大多數添加劑均為鈉鹽或鉀鹽，具有較好的水溶性，因此采取了直接用水提取的方法?？紤]到某些罐頭中可能使用增稠劑，樣品不易分散，另外某些添加劑(如山梨酸)在低pH值條件下提取效率欠佳，采取了調節pH值至中性并加熱提取的方法，試驗證明提取效果較佳，另外為了少引入其他組分，采用氨水調節樣品的pH值，而沒有使用NaOH。對于對羥基苯甲酸酯類，由于其在中性狀態下水溶性不是很好，采取在提取液中加入乙腈的方法，以提高其提取效率；由于乙腈的加入，還可明顯減少某些干擾物如蛋白質等對測定的影響。通過基質加標試驗，證明前處理方法可滿足篩查的要求。

2.2液相色譜條件的優化

由于篩查的組分多達37種，快速、高效的分離尤為重要。本實驗選用了Waters公司的AcquityRUPLCRBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)做為分析柱，以乙腈和10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，進行梯度洗脫，結果表明絕大多數添加劑分離良好，全部組分在8 min內出峰，包括系統平衡在內，僅需10 min即可完成一個樣品的篩查。

2.3質譜參數的優化

將各添加劑標樣溶液注入質譜儀，對質譜參數進行優化，以獲得最佳的靈敏度和足夠的子離子信息，優化的結果見1.3.2。錐孔電壓和碰撞能量是質譜參數中最重要的2個。錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度，隨著錐孔電壓的升高，各添加劑響應值逐漸增強，但錐孔電壓過高可能導致色素分子離子在離子源內發生碰撞解離，反而影響母離子的靈敏度。經實驗，在錐孔電壓25～30 V、碰撞能量為12 eV時，絕大部分添加劑可獲得較強的準分子離子峰。為得到各組分的碎片離子，增強本篩查方法的可靠性，同時又不希望損失其準分子離子的靈敏度，采用了MSE的采集模式，即同時采集2個不同碰撞能量通道的數據，低能通道監測準分子離子，高能通道采集碎片離子的信息。低能通道碰撞能量為12eV，高能通道碰撞能量為15～40 eV。

2.4質量測定準確度

表1列出了37種食品添加劑的元素組成、理論質量和測定值以及測定質量偏差，相對質量偏差均小于3×10-6，其中28種添加劑測定的相對質量偏差小于2×10-6。結果表明應用本方法測定水果罐頭中的食品添加劑能夠獲得較高的質量精度。

表1 超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜測得的水果罐頭中添加37種食品添加劑的精確質量和相關數據

續表1

續表1

圖1為各食品添加劑添加量為5 mg/kg樣品的總離子流圖；圖2為在0.02 u的質量窗口內提取的37種食品添加劑準分子離子流圖。提高質量測定的準確度有利于提高篩查的可靠性。以某次測定中專利藍的提取色譜圖為例，在0.7u的質量窗口內提取專利藍的色譜圖見圖3；在0.02 u的質量窗口內提取的專利藍的色譜圖見圖4。對照這2張提取離子色譜圖，發現在0.7u質量窗口內提取的色譜圖中，專利藍前面有一個小峰，而0.02 u的質量窗口內該峰幾乎消失，查看該峰的全掃描質譜圖，可見其質量數為557.142 9，其中一個同位素峰為559.144 0，而專利藍的質量數為559.158 9，當提取質量窗口為0.02 u時，該峰不能被提取(圖4)，不會造成干擾；而在低分辨質譜的測定條件下，即與專利藍同時被提取(圖3)。由此可見，如果質量測定的準確度不足，很容易出現假陽性的篩查結果。同時，測定了目標物的準確質量，更容易獲得清晰、高信噪比色譜圖，也有利于結果的定量和降低檢出限。在進行未知物篩查時，測定了分子離子的精確質量，即可通過元素組成解析軟件所設定的質量偏差和元素組成的種類、數量，推測可能的分子式組成，分子離子測定的質量偏差越小，可能的分子式數量越少，更容易得到準確的篩查結果。

圖1 37種食品添加劑測定的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 37 food addtives

圖2 在0.02 u質量窗口提取的37種食品添加劑準分子離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 37 food addtives

圖3 0.7 u質量窗口內提取的專利藍色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram for patent blue V in Mass window of 0.7 u

圖4 0.02 u質量窗口內提取的專利藍色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram for patent blue V in Mass window of 0.02 u

A-專利藍的全掃描質譜圖；B-雜質的全掃描質譜圖圖5 專利藍及其雜質的全掃描質譜圖Fig.5 Full scan mass spectra of patent blue V and its impurities

2.5對檢出目標化合物的確證

表1所列添加劑中，很多在某些國家和地區不得在水果罐頭中使用，因此對篩查結果的確證尤為重要。根據歐盟指令2002/657/EC[24]的規定，使用高分辨串聯質譜獲得的一個母離子為2分，一個子離子為2.5分，對禁用物質的定性要求為4分。本方法測定35種食品添加劑，每組分均采集一個母離子、1～2個子離子，完全可滿足目標化合物定性確證的要求。圖6列出了合成色素新紅的高能通道顯示的質譜圖和母離子、子離子的提取色譜圖。

圖6 新紅色素的二級質譜圖Fig.6 Tandem mass spectra of New Red

A、B-兩個片的提取色譜圖；C-母離子的提取色譜圖圖7 新紅色素母離子和2個碎片離子的提取色譜圖Fig.7 Extracted ion chromatogram of mew red and its fragment ion

有些色素的分子式相同，比如莧菜紅和胭脂紅，母離子都為536.973 2，但莧菜紅的主要碎片離子為316.964 4(圖8)，而胭脂紅為508.968 0和429.010 3(圖9)。另外，莧菜紅保留時間為1.33 min，胭脂紅為2.79 min，二者很容易區分，不會導致誤判。因此，本方法可提供充足的包括保留時間、化合物母離子、子離子等定性信息，用于確證篩查出的目標物，篩查和確證可以同時進行。

圖8 莧菜紅二級質譜圖Fig.8 Tandem mass spectra of amaranth

圖9 胭脂紅二級質譜圖Fig.9 Tandem mass spectra of ponceau 4R

2.6線性范圍、回收率和檢出限

在確定的實驗條件下，用40%乙腈溶液配制系列不同濃度(0.5～50 μg /mL)的混合食品添加劑標準溶液進行測定，以各組分的峰面積(y)對其濃度(x, μg /mL) 繪制標準曲線，除喹啉黃、酸性紅92、孟加拉紅等組分以外，其余添加劑相關系數(r)均優于0.99,表明各種添加劑在0.5～50 μg/mL內具有較好的線性關系，結果見表2。這一工作曲線是根據水果罐頭中各食品添加劑的可能用量確定的，雖然本方法對于大部分添加劑具有更低的檢出限，但實際使用時含量太低不能起到應有的作用，考慮到本方法是篩查方法而非定量方法，故沒有對每種添加劑單獨配置工作曲線。

在空白水果罐頭中添加不同水平的添加劑混合標準溶液，按照1.2的步驟進行處理，每個添加水平平行測定5次，得到各添加劑的回收率、相對標準偏差(RSD)、方法的最低定量限(LOD) (S/Ngt;10)，具體結果見表2。

表2 37種食品添加劑的線性范圍、回收率和檢出限

續表2

2.7方法的應用

應用本方法測定了葡萄罐頭、桃罐頭、橘子罐頭等樣品30余批，在部分樣品中檢出糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜等添加劑。篩查結果與相應食品添加劑的定量方法測得值比較，部分吻合較好，部分存在差異。這可能是由于本方法采用了電噴霧電離源，樣品間存在程度不同的基質效應。考慮到本方法的主要特點是快速定性和高通量篩查，測定時沒有采用空白基質提取液來稀釋標樣，因而在某些樣品基質的定量方面與標準方法有一定的差距。

3 結論

研究結果表明，超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜是對水果罐頭中多種食品添加劑進行快速篩查的有效技術，具有分離效率高、定性確證準確并能定量的特點，可用于多種食品添加劑的篩查。同時由于四極桿/飛行時間質譜是以全掃描的方式采集數據，記錄了篩查樣品中一定質量數范圍內的全部信息，而不僅是本方法所研究的37種食品添加劑，因此可以很方便地對以往的篩查數據進行再次分析，從而找出關注的其他目標物。正是由于具有這些特點，超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜快速篩查多種食品添加劑的方法具有廣闊的應用前景。

[1] 肖學成.薄層色譜法同時測定食品中4種添加劑的方法介紹[J]. 實用預防醫學,1998,5(2)：60-61.

[2] 劉勝男，張國慶,王素方，等.高效液相色譜法同時測定果蔬汁飲料中20種禁限用食品添加劑[J]. 輕工學報，2016,31(4)：23-29.

[3] 丁梅，辛若竹，卜麗偉.可變波長液相色譜法同時測定食品中18種常用食品添加劑研究[J]. 糧食與油脂，2014,27(6)：50-55.

[4] 林海丹，鄒志飛，秦燕，等.高效液相色譜法同時測定食品中18種食品添加劑[J].食品科學，2013,34(8)：228-231.

[5] 馬康，蔣孝雄，趙敏，等.高效液相色譜法同時測定軟飲料中20種食品添加劑[J].分析化學，2012,40(11)：1 661-1 667.

[6] 黃永輝，余清，林欽，等.超高效液相色譜法同時測定碳酸飲料中的22種食品添加劑[J].分析測試學報，2011,30(8)：877-882.

[7] 劉英，尹州，鄒曉筱，等.高效液相色譜法同時測定蜜餞中的16種食品添加劑[J].分析測試學報，2011,30(6)：651-655.

[8] 李穎.高效液相色譜法測定調味品和飲料中常見17種食品添加劑[J].中國衛生檢驗雜志，2010,20(11)：2 738-2 740.

[9] 王駿，胡梅，張卉，等.超高效液相色譜快速測定飲料中的16種食品添加劑[J]. 食品科學，2010,31(2)：195-198.

[10] 李秀琴，張慶合，楊總.高效液相色譜法同時測定肉制品中的6種食品添加劑[J]. 色譜，2010,28(12)：1 204-1 208.

[11] 李春娟,鞠福龍,李東剛. GC-MS法同時檢測葡萄酒中10種防腐劑和抗氧化劑[J]. 中國釀造，2009,28(6)：149-152.

[12] 湛嘉，俞雪鈞，黃偉，等.復雜基質食品中7種添加劑的氣相色譜/質譜檢測方法[J]. 分析科學學報，2008,24(6)：729-731.

[13] 曹淑瑞，徐芬，張雷，等.凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜法同時測定食品中3種抗氧化劑[J]. 食品科學，2013,34(12)：160-164.

[14] 寇立娟，梁春實，臧金海.中性氧化鋁柱凈化-氣相色譜/質譜法測定食品中富馬酸二甲酯的含量[J]. 食品與發酵工業，2009,35(12)：134-136.

[15] 李東剛，李春娟，劉敬東.GC-MS-SIM檢測糕點中的防腐劑和抗氧化劑[J]. 分析儀器，2009,40(4)：56-60.

[16] 王震，石麗珠.超高效液相色譜-串聯質譜測定飲料和酒中防腐劑與甜味劑[J]. 食品安全質量檢測學報，2014,5(4)：1 179-1 184.

[17] 于洋，盧靜.離子色譜和液相色譜串聯質譜法測定食品中的添加劑[J]. 化工管理，2015,28(14)：66.

[18] 李晶，徐濟倉，繆明明，等.固相萃取-超高效液相色譜/串聯質譜同時檢測飲料中13種禁限用食品添加劑[J]. 分析科學學報，2013,29(4)：488-492.

[19] 曹婭，孫利，凌云，等.液相色譜-串聯質譜測定食用植物油和調味油中27種添加劑(物)[J].食品科學，2013,34(4)：129-134.

[20] 馮峰，楊爍，凌云，等.超高效液相色譜-串聯質譜快速篩查葡萄酒中的14種禁用食品添加劑[J].分析化學，2011,39(11)：1 732-1 737.

[21] 趙冰，沈學靜.飛行時間質譜分析技術的發展[J]. 現代科學儀器，2006,23(4)：30-33.

[22] 吳煒亮，李曉明，朱文亮，等.飛行時間質譜技術及其在食品安全檢測中的應用[J]. 食品與機械，2015,31(3)：236-241.

[23] 錢疆，楊方，陳弛，等.超高效液相色譜飛行時間質譜測定食品中36種合成色素[J]. 食品科學，2013,34(6)：215-218.

[24] Commission Decision Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results Text with EEA Relevance; Notified under Document Number C(2002)3044).

Screeningmethodof37foodadditivesinfruitcansbyUPLC-Q/TOF

WANG Jun*, SU Shu-fang, HU Mei, XU Da-wei, ZHU Jian-hua

(Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China)

A screening method of 37 food additives in fruit cans was developed by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry. The samples were extracted with acetonitrile-water, and separated on an Acquity UPLC BEH C18column using ammonium acetate solution -acetonitrile as the mobile phase and measured by UPLC/Q/TOF mass with electrospray ioninzation in negative mode. The qualitative analyses were based on the characteristic fragment ions of every compounds. The quantitation limitation were 0.02-0.5 mg/kg; the linear relationship was good in the concentration range of 0.5-50 μg/mL, the recoveries were 79.5%-103.5%. The method is simple, sensitive, accurate and suitable for screening food additives in fruit cans．

UPLC-Q/TOF;food additives;Screening method;fruit cans

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014063

學士，研究員(本文通訊作者，E-mail:13953105081@163.com)。

山東省重點研發計劃項目(2015GSF120018)

2017-02-16，改回日期：2017-05-17