烏頭湯對膝骨關節炎大鼠細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響

陳 俊 ，葉錦霞 ，林 潔 ，付長龍 ，劉獻祥 ，吳廣文

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

烏頭湯對膝骨關節炎大鼠細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響

陳 俊1，葉錦霞2，林 潔2，付長龍2，劉獻祥2，吳廣文2

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

目的 通過觀察烏頭湯對膝骨關節炎大鼠血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的影響，探討其治療膝骨關節炎的作用機制。 方法 采用隨機數字法將60只SD大鼠分為空白組15只和造模組45只。造模組在第1、4、7天采用4%木瓜蛋白酶關節腔內注射復制膝骨關節炎模型。成功造模后，隨機分為模型組、對照組和治療組各15只。空白組和模型組灌服0.9%生理鹽水；對照組灌服雙氯芬酸鈉緩釋膠囊；治療組灌服烏頭湯。2周為1個療程，療程期間休息2 d，共干預4個療程。觀察4組大鼠一般情況、關節液情況及血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3濃度變化。 結果 與空白組比較， 模型組血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3濃度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，對照組與治療組血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3濃度均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，治療組血清和關節液中IL-6濃度明顯升高（P＜0.05）。 結論 烏頭湯通過降低血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎癥反應，降低細胞外基質降解，減緩軟骨退變，從而起到治療KOA的目的。

膝骨關節炎；IL-1β；IL-6；TNF-α；MMP-3；烏頭湯

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）屬中醫“痹癥”范疇，是中老年人常見病，以關節疼痛、活動障礙為主要特征的慢性退行性疾病［1］。研究發現炎癥因子與KOA發生發展密切相關［2-6］。中醫藥防治KOA有一定優勢［7-8］，但其作用機制不明。烏頭湯出自東漢·張仲景《金匱要略》，長期應用于風寒濕痹型KOA的臨床治療，療效可靠。本實驗擬通過觀察烏頭湯對KOA大鼠血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響，探討烏頭湯治療KOA的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只清潔級2月齡雄性SD大鼠，體質量（200±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗藥物 烏頭湯藥物組成：川烏6 g，麻黃9 g，黃芪 9 g，芍藥 9 g，甘草 9 g，由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院藥劑科提供。雙氯芬酸鈉緩釋膠囊（中國藥科大學制藥有限公司）。

1.3 實驗試劑 IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-3酶聯免疫試劑盒（美國R&D systems公司）；水合氯醛粉末（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 實驗儀器 ELx800型全自動酶標儀（美國BioTek公司）；Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；H-1微型混合器（上海康禾光電儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 烏頭湯藥液的制備 先將制川烏浸泡30 min后水煎煮 1 h，再加入剩余中藥煎煮1 h，過濾取藥液。將藥液水浴濃縮至含生藥量為4.2 g／mL，冷卻后置于 4℃冰箱保存，備用。

2.2 動物分組與造模 SD大鼠60只，采用隨機數字表法分為空白組（15只）和造模組（45只）。造模組SD大鼠于第1、4、7天采用膝關節腔注射4%木瓜蛋白酶復制膝骨關節炎模型［9］。術后2周，將造模組隨機分為模型組、對照組、治療組各15只。

2.3 藥物干預 空白組和模型組按照3 mL／（kg·d）予0.9%生理鹽水灌胃。動物給藥劑量換算參考文獻［10］，對照組給予雙氯芬酸鈉緩釋膠囊（1 mg／mL），灌胃量根據大鼠每周體質量按照10 mL／（kg·d）計算；治療組給予烏頭湯（4.2 g／mL），灌胃量根據大鼠每周體質量按照 10 mL／（kg·d）計算。2周為1個療程，共干預4個療程，療程期間休息2 d（給藥期間，每周稱1次體質量以調整給藥劑量）。

2.4 取材 干預4個療程后，予10%水合氯醛麻醉，膝關節備皮，逐層分離至關節囊，反復活動膝關節，將關節液擠壓至髕上囊內側，于其髕韌帶附著點外上方，用1 mL醫用注射器穿刺入關節腔內，注入0.9% 氯化鈉注射液0.5 mL，抽取關節液，置入EP管中，－20℃保存，待檢測。抽取關節液后，常規腹主動脈采血，3 000 rpm離心15 min，吸取上層血清，－20℃保存，待檢測。

2.5 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3濃度檢測 用ELISA法檢測血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的濃度。具體如下：空白孔加樣品稀釋液100μL，余孔加待測樣品 100μL，酶標板覆膜，37℃反應120 min。每孔加生物素標記抗原工作液100μL，37℃反應60 min。洗板3次。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μL，37℃反應60 min。棄去孔內液體，洗板3次。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色。依序每孔加終止液50 μL，終止反應。在加終止液后15 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。以標準品濃度作為橫坐標，OD值作縱坐標，計算出標準曲線的4-Parameter回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

2.6 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析；不符合正態分布采用秩和檢驗。

3 結 果

3.1 一般情況 ① 空白組大鼠皮毛光亮，喜活動，反應良好，飲食正常；② 模型組大鼠皮毛暗淡，膝關節腫脹明顯，患肢拒碰、不愿活動，被動活動時出現跛行或患肢拖行，懶食；③ 治療組與對照組大鼠干預后膝關節腫脹程度均減輕，主動活動時間增加，反應靈敏，食量增加，2組比較無明顯差別。

3.2 關節液變化 空白組大鼠關節液無色、透明清亮、黏稠狀；模型組大鼠關節液呈淡黃、半透明，濃稠偶見白色絮狀物，量增多；治療組和對照組大鼠關節液呈淡黃、透明，無絮狀物，量正常。

3.3 4組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3濃度比較 見表1。

表1 4 組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 濃度比較（x±s）pg／mL

3.4 4組關節液IL-1β、IL-6、TNF-α和 MMP-3濃 度比較 見表 2。

表2 4 組關節液 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 濃度比較（x±s）pg／mL

4 討 論

近年來，研究發現細胞因子與膝骨關節炎進程密切相關［11-12］。MMPs是一類廣泛存在于全身結締組織中的一種蛋白酶，在膝骨關節炎病理過程中，滑膜細胞和軟骨細胞分泌過量MMPs，打破MMPs及其抑制劑TIMPs的平衡，使MMPs相對增多。而MMPs能直接切斷軟骨的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，導致膠原網受到破壞，細胞外基質成分游離出軟骨，使軟骨受損并失去彈性，原本被關節軟骨基質包埋的軟骨細胞在力學和炎性因子的作用下發生凋亡，最終導致軟骨破壞［13］。MMP-3又名間充質降解素，作為MMPs家族中的重要酶類，MMP-3主要通過參與間質膠原酶的激活來降解Ⅱ型膠原，并能激活其他蛋白酶原，加速軟骨的破壞進程。研究表明骨關節炎患者血清和關節液中MMP-3含量較健康人增高，其表達水平與軟骨破壞程度相一致［14］。IL-1β可誘使軟骨細胞內線粒體功能紊亂，導致活性氧的產生，進而通過死亡受體途徑刺激軟骨細胞死亡區域蛋白mRNA的表達，介導軟骨細胞凋亡，從而破壞軟骨層結構，導致 OA 的發生與發展［15］；IL-1β 還可通過誘導軟骨細胞外基質層中MMPs的表達，進一步破壞軟骨結構［16-18］。TNF-α是炎癥反應的重要調節劑，在OA發病和進展中起著關鍵作用。TNF-α作用機制與IL-1β類似，兩者具有協同作用［19-21］。IL-6是一種在Ⅱ-1、TNF-α等誘導下由巨噬細胞、軟骨細胞、破骨細胞等細胞產生的細胞因子，具有激活 B細胞和 T細胞等多種生物學活性。此外，IL-6可增加滑膜組織炎癥細胞，刺激軟骨細胞增殖，誘導放大 IL-1β增加 MMP的合成作用和抑制蛋白多糖產生，形成惡性循環，加速軟骨破壞進程［22-23］。

烏頭湯出自《金匱要略》：“病歷節不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之。烏頭湯方：治腳氣疼痛，不可屈伸。”主治寒濕痹阻，陽氣不通所致的寒濕歷節。方中制川烏為君藥，有溫經散寒止痛的作用；麻黃為臣藥，能祛風發汗通陽行痹；芍藥緩急止痛，使陰陽宣通，氣血暢行，利關節屈伸；黃芪益氣固衛，助溫經止痛時，又可防麻黃過于發散，有扶正祛邪之效，兩藥共用為佐藥；炙甘草為使，合益氣減毒之功。諸藥合用，共奏溫經散寒，祛濕止痛之效，能針對KOA痹癥的病因病機起治療作用。本實驗結果顯示，與空白組相比，模型組血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3水平均明顯升高，而經過烏頭湯治療后，IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 水平均明顯降低，提示烏頭湯治療KOA的作用機制可能是通過降低血清和關節液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎癥反應，降低細胞外基質降解，減緩軟骨退變，從而起到治療KOA的目的。

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R285.5

A

1000-338X（2017）05-0027-03

2017-05-02

福建省衛生計生青年科研課題（2017－2－46）；陳可冀中西醫結合發展基金（CKJ2016010）

陳俊（1986—），女，主要從事中西醫結合防治骨關節炎研究。

吳廣文（1982—），男，醫學博士，副研究員。E-mail：wuguangwenfj@163.com