劉貝貝， 于 斐， 玉崧成， 劉利娥， 吳擁軍

(1.鄭州大學 公共衛生學院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學 化學與分子工程學院 河南 鄭州 450001)

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017026

增強化學發光酶聯免疫分析用于伏馬菌素B1的快速檢測

劉貝貝1,2， 于 斐1， 玉崧成1， 劉利娥1， 吳擁軍1,2

(1.鄭州大學 公共衛生學院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學 化學與分子工程學院 河南 鄭州 450001)

以抗原-抗體的免疫反應及化學發光為基礎，以辣根過氧化物酶(HRP)標記伏馬菌素B1(FB1)為半抗原、魯米諾-H2O2為發光底物，對羥基聯苯為化學發光增強劑，建立了一種新型的FB1快速檢測方法——增強化學發光酶聯免疫分析法，相關系數R為0.991 6，線性范圍為200～1 400 μg/L，檢測限為91.3 μg/L.在不同的加標水平下，回收率為85.9%～115.4%，與之相對應的板內RSD為9.1%～10.2%(n=6)，板間RSD為10.6%～12.4%(n=6)，與其他真菌毒素交叉反應率較低.與傳統的檢測方法(酶聯免疫吸附測定和高效液相色譜法)進行了比較，結果表明，本研究建立的方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、檢測快速，能夠用于大批量實際樣品的快速檢測.

增強化學發光酶聯免疫分析； 伏馬菌素B1； 快速檢測

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017026

0 引言

伏馬菌素作為一種霉菌毒素，是串珠鐮刀菌和再育鐮刀菌代謝產生的水溶性物質[1-2].特別是伏馬菌素B1(FB1)毒性較強，對食品及谷物污染的情況在世界范圍內普遍存在.FB1不僅降低了農產品和飼料的品質，使經濟遭受巨大損失，而且還可以通過污染了FB1的肉、乳等動物源性食品進入人體，給人們的健康造成威脅[3].研究表明，FB1能引起馬腦質軟化癥和神經性中毒而呈現運動失調和意識障礙甚至死亡，還能使豬產生肺水腫綜合征，并有肝、腎毒性，可致動物肝癌和食道細胞增生[4].FB1可能會誘發人類患食道癌等疾病，已被國際癌癥中心劃為2B類致癌物.另外，據聯合國糧食與農業組織(FAO)統計結果顯示，現已有6個國家制訂了玉米中FB1的限量標準，而我國對FB1的毒性研究還較少，尚未制訂食品與飼料中FB1的限量標準. 因此，迫切需要測定谷物及其制品中FB1的含量，故建立測定伏馬菌素的快捷、精確、安全的檢測方法意義深遠.

對伏馬菌素的痕量檢測，國內外已有薄層色譜(TCL)、高效液相色譜(HPLC)[5]、色譜與質譜聯用技術(LC-MS)[6]、金免疫層析(GICA)[7]及酶聯免疫吸附測定(ELISA)[8]等方法.雖然HPLC或LC-MS等儀器檢測方法準確性、重現性好，但樣品前處理過程復雜，損耗量大，儀器昂貴，限制了其在大批量實際樣品檢測中的廣泛應用；而ELISA免疫法的靈敏度偏低.因此，亟須建立一種快速簡便、特異性好、靈敏度高的檢測方法.

化學發光酶聯免疫分析(chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLEIA)的靈敏度高，線性范圍寬，無須復雜的樣品前處理，操作簡便，分析速度快，可實現自動化.基于魯米諾-H2O2-HRP的經典化學發光體系，發光信號會衰減，限制了其廣泛應用.研究發現，當加入一些酚類物質，背景值會被抑制，發光信號不同程度地被增強，且發光時間有所延長.本實驗選取的增強劑為對羥基聯苯(PPP)，與其他酚類增強劑對比，其增強效果更為顯著.據此，本實驗建立了一種FB1的快速CLEIA檢測方法——增強化學發光酶聯免疫分析(enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，ECLEIA)，并對實際樣品進行了檢測.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

化學發光免疫分析儀(Centro XS3 LB960，BERTHOLD公司)；紫外可見分光光譜儀(UV-1601，日本島津公司)；紅外光譜儀(PE-1710，西德PE公司)；電熱恒溫培養箱(DHG-9146A，上海精宏實驗設備有限公司).

1.2 主要試劑及溶液

FB1單抗(Santa Cruz Biotechnology)、FB1標準抗原(Sigma)、魯米諾(Sigma)、過氧化氫(昊天化學有限公司)、辣根過氧化物酶(Sanland)、對羥基聯苯(阿拉丁)、牛血清白蛋白(Sigma)；所用試劑均為分析純，水為MillQ純水.

包被液：Tris-HCl緩沖液(pH 9.6)；封閉液：1%OVA的PBS緩沖液；洗滌液：0.05 mol/L的PBS緩沖液(含0.05%的TRITON-X100)；樣品稀釋液：0.05 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4).顯色液A：魯米諾+對羥基聯苯；顯色液B：新鮮配制的過氧化氫(H2O2)溶液.

1.3 樣品的前處理

分別將正常小麥、霉變小麥和霉變玉米粉碎、研磨，過分子篩，然后進行四分法縮分.取5 g樣品放入100 mL具塞試管中，加入75%的甲醇-水溶液50 mL，振蕩30 min，離心15 min，濾紙過濾，4 ℃保存備用，并用PBS緩沖液做適量稀釋后進行檢測.

1.4FB1酶標記物的制備

根據文獻[9]，采用酶聯免疫吸附方法，在線性范圍內將不同方法制備的偶聯物用于FB1標準品的測定.結果顯示，一步戊二醛法有較大的響應值，靈敏度最高，故選擇一步戊二醛法制備FB1-HRP偶聯物并對其進行鑒定.

1.5 ECLEIA方法的建立

化學發光底物濃度的大小直接影響相對光單位(RLU)的大小，從而影響測定方法的靈敏度.故對魯米諾濃度、H2O2濃度、增強劑濃度、體系的pH值進行優化.經過優化，用包被液稀釋FB1單克隆抗體至所需濃度，移取100 μL到96孔微孔板(滅菌處理)上，37 ℃溫育2 h，洗滌3次，拍干.每孔加入200 μL封閉液，37 ℃溫育2 h，洗滌5次，拍干.每孔加入不同濃度的FB1標準溶液、FB1-HRP偶聯物各100 μL，每行的前兩孔為空白對照孔(0.01 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液)，37 ℃溫育1 h，洗滌5次，拍干.每孔依次各加入等量的顯色液A和B，于化學發光免疫分析儀上測定各孔的RLU.

1.6 方法學評價

1.6.1標準曲線的繪制 用PBS緩沖液(pH 7.4)配制質量濃度分別為200、400、800、1 000、1 200、1 400 μg/L的FB1標準溶液，按1.5中步驟進行ECLEIA，測定不同質量濃度下的RLU，根據FB1的標準質量濃度與RLU的關系，應用不同形式的方程對其進行線性擬合.

1.6.2精密度評價 取一塊聚苯乙烯板，分別配制低、中、高3個水平質量濃度(400、800、1 200 μg/L)樣品，每個水平平行測定6次，得出板內標準偏差；另取不同的聚苯乙烯板采用直接競爭ECLEIA測定FB1的含量，分別配制400、800、1 200 μg/L 3個水平質量濃度樣品，每個水平平行測定6次，求出各自的板間標準偏差，考察該方法的精密度.

1.6.3準確度評價 采用加標回收率的方法對所建立方法的準確度進行評價，在空白樣品中加入質量濃度分別為200、600、800 μg/L的FB1標準品，按照1.5中步驟測定加標孔的發光值，根據標準曲線求出加標回收率，考察該方法的準確度.

1.6.4特異性評價 選取真菌毒素嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)，用PBS緩沖液配制各系列不同質量濃度樣品，按照ECLEIA標準曲線的操作步驟得到相應的抑制率，然后計算交叉反應率，過程如下：以不同質量濃度的抗原和結構類似抗原物質分別求各自的IC50(當發光衰減至最大相對光單位一半時該物質的質量濃度)，按公式S=y/Z×100%(S為交叉反應率；y為抗原的IC50；Z為結構類似抗原物質的IC50)計算交叉反應率，考察該方法的特異性.

1.6.5方法學比較 把已建立的ECLEIA法用于小麥樣品中FB1的檢測，分別在不含FB1的小麥樣品中加入已知濃度的FB1標準品制成待測樣本，按照1.5節中的步驟進行操作，檢測小麥樣品中FB1的含量.用FB1的常用檢測方法(HPLC[10]、ELISA[11])對加標小麥樣品進行檢測，并進行方法學的比較，同時用ECLEIA與HPLC對霉變小麥、霉變玉米進行了測定.

2 結果與討論

2.1 ECLEIA的原理

ECLEIA的原理如圖1所示.采用直接競爭法[12]，首先將FB1單克隆抗體包被到固相載體上，孵育后洗滌、封板.然后加入待測抗原和同種酶標記抗原的混合溶液，使之與固相抗體發生競爭性反應，對照孔只加酶標抗原，孵育后洗滌.結合的酶標抗原量和待測抗原量成反比，加入發光底液和增強劑，對羥基聯苯可作為HRP的第二反應底物，顯著加快酶的循環速度，增大魯米諾游離基的濃度，從而增強化學發光強度，產生發光.

2.2FB1-HRP的表征

FB1、HRP和FB1-HRP的紫外可見光譜見圖2.HRP在405、265、205 nm有最大吸收峰；FB1在200 nm附近有最大吸收峰；而FB1-HRP在405、265、205 nm也有最大吸收峰，初步推斷偶聯成功.

圖1 ECLEIA原理示意圖Fig.1 ECLEIA principle diagram

圖2 FB1、HRP和FB1-HRP的紫外可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of FB1, HRP and FB1-HRP

FB1、HRP和FB1-HRP的紅外吸收光譜見圖3.FB1-HRP在3 410～3 460 cm-1范圍內具有較強、較寬的吸收峰，既有FB1分子N—H鍵伸展振動產生的3 410 cm-1吸收峰，也有HRP分子內O—H鍵伸展振動產生的3 462 cm-1吸收峰；并且在1 612 cm-1出現FB1的吸收峰，故可判斷偶聯成功.

2.3 化學發光實驗條件的優化

由圖4可知，隨著魯米諾(luminol)濃度的增加，體系發光強度逐漸增加，當魯米諾濃度大于7×10-4mol/L時，發光值開始衰減，故選擇魯米諾的濃度為7×10-4mol/L用于后續實驗.同理，過氧化氫(H2O2)的濃度選擇為4.0×10-3mol/L，對羥基聯苯(PPP)的濃度選擇為2×10-4mol/L，緩沖體系Tris-HCl 的pH選擇為8.5，此時RLU最大.

2.4 標準曲線、精密度、準確度及特異性

2.4.1標準曲線 根據FB1標準品質量濃度與RLU的關系，應用不同形式的方程對其進行擬合，并計算不同回歸方程的相關系數.選擇實際走勢和擬合曲線最吻合(即曲線相關系數最接近1.0)的方程，作為實驗最終的線性方程.如表1中用不同方法進行擬合的相關系數R中，B/B0-C與RLU-C數值接近，考慮到檢測限及回收率的計算，最終采用B/B0-C為本實驗的標準曲線方程，在200～1 400 μg/L范圍內，回歸方程為y=-0.000 3x+0.857 4，相關系數R=0.991 6，R2=0.983 3.

2.4.2精密度 通過表2中數據可知，采用直接競爭ECLEIA方法檢測FB1，在低、中、高3個質量濃度的板內相對標準偏差為9.1%～10.2%(n=6)，板間相對標準偏差為10.6%～12.4%(n=6).由此可以看出，建立的方法精密度很好，可以用于實際樣品的檢測.

圖3 FB1、HRP和FB1-HRP的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of FB1, HRP and FB1-HRP

圖4 化學發光實驗條件的優化Fig.4 Optimization of chemical experiment conditions

2.4.3準確度 由表3數據可知，高、中、低3個質量濃度的加標回收率在85.9%～115.4%范圍內，整體而言，方法準確度良好，可以用于實際樣品的檢測.

2.4.4特異性 通過對比谷物中常見的3種生物毒素DON、ZEN、AFB1，對方法的特異性進行了論證.由表4可知，FB1單抗針對谷物中常見的3種生物毒素的交叉反應率(S)均低于2.0%，接近無交叉反應，說明伏馬菌素FB1單克隆抗體對其他真菌毒素無特異性反應，從而間接表明了建立的ECLEIA方法測定FB1具有良好的特異性.

表1 擬合的標準曲線及相關系數的比較

2.4.5方法學的比較 用FB1的傳統檢測方法(HPLC[10]、ELISA[11])對加標小麥樣品進行檢測，并進行方法學的比較，評價3種檢測方法的特點.3種方法的檢測限、線性范圍、回收率及精密度結果如表5所示.并同時用ECLEIA與HPLC對霉變小麥、霉變玉米進行測定，結果如表6所示.

由表中數據分析可知，雖然ECLEIA、ELISA兩種方法具有免疫分析方法所特有的低成本、高通量、預處理簡單及快速等優點，但光吸收是ELISA方法檢測的特點，OD值會受到外源性物質的影響；而ECLEIA方法與其他發光現象的區別在于發光來源的不同，它吸收化學反應過程中釋放的能量，避免了外來光源的干擾，提高了信噪比，增強劑和儀器光電倍增管的存在可增強發光強度以及延長發光時間，從而提高了體系檢測的靈敏度.

表2 直接競爭ECLEIA方法的板內和板間的相對 標準偏差(n=6)

表3 加標回收率測定結果(n=6)

表4 ECLEIA方法測定FB1的特異性(n=6)

表5 3種方法測定FB1的結果比較

表6 ECLEIA與HPLC測定霉變小麥、霉變玉米比較

從前處理角度看，ECLEIA和ELISA占據優勢，但ELISA方法的線性范圍窄；從樣品檢測的靈敏度角度看，ECLEIA和HPLC差別不大，都能滿足大多數樣品中真菌毒素最低限量標準檢測的要求.因此，ECLEIA方法對于真菌毒素的監控有很大的應用前景.

3 結論

用以魯米諾-HRP-H2O2-對羥基聯苯為體系的增強化學發光酶聯免疫分析法(ECLEIA)對FB1含量進行了測定，方法檢測限為91.3 μg/L，線性范圍為200～1 400 μg/L，與其他常用檢測方法(HPLC法和ELISA法)進行方法學比較，得出了ECLEIA法具有高靈敏度和高特異性，檢測快速，樣品前處理簡單，適用于大批量樣本的檢測，能夠對谷物中的痕量真菌毒素進行監測，并有望實現現場檢測.

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(責任編輯：孔 薇)

EnhancedChemiluminescenceEnzyme-linkedImmunoassayforRapidDetectionofFumonisinB1

LIU Beibei1,2, YU Fei1, YU Songcheng1, LIU Li′e1, WU Yongjun1,2

(1.CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.CollegeofChemistryandMolecularEngineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Based on the immune reaction between antigen and antibody and chemiluminescence, a new method for rapid detection of fumonisin B1was established using luminol-H2O2as luminescent substrates and the hydroxy diphenyl as chemiluminescence enhancer, and named as enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay(ECLEIA). On the basis of optimizing the experimental conditions, the limit of detection was 91.3 μg/L, and the linear range of the ECLEIA method for FB1determination was from 200 μg/L to 1 400 μg/L, while the correlation coefficient was 0.991 6. Furthermore, the relative standard deviations of intra-assay and inter-assay were 9.1%～10.2%(n=6) and 10.6%～12.4% (n=6),respectively. The recoveries were 85.9%～115.4%, and the cross-reactivity rates with object analogues were low. Compared with other common detection methods (HPLC and ELISA), ECLEIA method had high sensitivity, high specificity, sample operation and rapid detection, which could be used for the fast testing of large quantities of real samples.

enhanced chemiluminescence enzyme-linked immunoassay; fumonisin B1; rapid detection

2017-02-16

國家自然科學青年基金項目(81402721).

劉貝貝(1991—)，女，河南鹿邑人，主要從事藥物分析研究，E-mail:1198107789@qq.com；通信作者：吳擁軍(1968—)，男，河南駐馬店人，教授，主要從事衛生檢驗和衛生毒理學研究，E-mail: wuyongjun@zzu.edu.cn.

O657.39

A

1671-6841(2017)04-0076-06