不同金屬納米溶膠對小鼠血清表面增強拉曼光譜的增強效應

劉 健， 郝倩云， 劉婉華， 刁振琦， 唐偉躍

(1.鄭州大學 信息工程學院 河南 鄭州 450001； 2.北京大學 人民醫(yī)院 北京 100045； 3.鄭州大學 物理工程學院 河南 鄭州 450001)

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017208

不同金屬納米溶膠對小鼠血清表面增強拉曼光譜的增強效應

劉 健1， 郝倩云2， 劉婉華3， 刁振琦3， 唐偉躍3

(1.鄭州大學 信息工程學院 河南 鄭州 450001； 2.北京大學 人民醫(yī)院 北京 100045； 3.鄭州大學 物理工程學院 河南 鄭州 450001)

以金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠為基底測定了小鼠血清表面增強拉曼光譜(SERS).觀察了血清蛋白質結構的主鏈、側鏈和二級結構的振動峰(958、1 003、1 015、1 146、1 352 cm-1)，以及血清中少量碳水化合物D-甘露醇和脂類的特征峰(527、1 469 cm-1)，并比較了3種金屬溶膠基底的SERS增強效應.結果表明，以金-銀合金納米溶膠為基底的SERS譜峰都得到增強，特別是527、958、1 003、1 146、1 352、1 469 cm-1處信號加強明顯.以銀納米溶膠為基底的SERS中蛋白質結構的振動峰也有一定的增強，但是在527 cm-1處只有一小峰，未見1 469 cm-1峰.以金納米溶膠為基底的SERS中蛋白質結構的振動峰也有所加強，但527、1 469、1 547 cm-1峰消失.實驗結果表明，金-銀合金納米溶膠的SERS活性最強，銀納米溶膠其次，金納米溶膠最差.

金屬納米溶膠； 表面增強拉曼光譜； 血清； 小鼠

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017208

0 引言

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)表征的是分子振動的信息，是以金屬粗糙表面或金屬納米粒子作為基底對分子進行檢測的一種光譜測量技術，在生物體系測量中能反映核酸、蛋白質、脂類等生物大分子的結構信息.SERS技術能使拉曼信號增強若干個數量級，并能在一定程度上減弱熒光背景, 所以非常適合對熒光背景很強的生物體系的檢測.近幾年SERS技術在檢測腫瘤血清方面得到初步發(fā)展，利用SERS技術能夠檢測腫瘤血清中分子結構、構象的微小變化.因此，根據血清拉曼光譜的改變可以對惡性腫瘤進行早期篩查.

在血清SERS研究中，要獲得高信噪比的SERS信號，對活性基底的研究至關重要.增強基底不同，對相同樣品的SERS增強效果不同.基底的表面形貌、血清分子與納米粒子的結合方式都會影響基底的活性[1-3].在所有的SERS活性基底中，金屬溶膠制備簡便、穩(wěn)定性高，具有很高的SERS增強因子.因此，本文以金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠作為血清SERS的增強基底，研究了不同金屬納米溶膠對血清SERS的增強效應，以期尋找到適合血清SERS檢測的高活性增強基底，研究結果將對利用血清SERS早期診斷惡性腫瘤具有重要的意義.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

實驗所用氯金酸、硝酸銀、枸櫞酸鈉均為分析純，購于上海化學試劑有限公司.實驗用水均為三次去離子水.硝酸銀溶液置于暗處，氯金酸溶液置于冰箱冷藏.

紫外分光光度計(Hitachi UV-3900)；透射電子顯微鏡(Hitachi H-600)；拉曼共焦顯微拉曼儀(法國 HORIBA Jobin Yvon，LabRAM HR Evolution), 激發(fā)光源為氦-氖離子激光器，激發(fā)光波長為632.8 nm, 光譜分辨率≤0.4 cm-1，到達樣品表面功率約為2 mW；電磁加熱攪拌器(上海司樂儀器有限公司，B11-2)；電子天平(艾德姆衡器有限公司，PGC753e).

1.2 實驗方法

1.2.1金屬納米溶膠的制備 銀納米溶膠的制備采用文獻[4]的方法，用枸櫞酸鈉還原硝酸銀溶液得到.具體步驟如下：將裝有200 mL質量濃度為1×10-4g/mL的硝酸銀溶液的燒杯放置到微波爐中加熱至沸騰, 取出后緩慢滴入4 mL質量分數為1%的枸櫞酸鈉溶液, 并伴隨劇烈地磁力攪拌，加熱攪拌60 min后，停止加熱，攪拌冷卻至室溫，得到銀納米溶膠.

金納米溶膠的制備采用文獻[5]的方法，用枸櫞酸鈉還原氯金酸溶液得到.具體步驟如下：將裝有100 mL質量濃度為5×10-4g/mL的氯金酸溶液的燒杯放置到微波爐中加熱至沸騰，將2 mL質量分數為1%的枸櫞酸鈉溶液緩慢加入到沸騰的氯金酸溶液中，然后放在磁力攪拌器上繼續(xù)加熱攪拌40 min后，停止加熱，使其自然冷卻至室溫，得到金納米溶膠，放入4 ℃的冰箱里備用.

金-銀合金納米溶膠的制備采用文獻[6]的方法，以枸櫞酸鈉為還原劑，將氯金酸和硝酸銀的混合溶液與枸櫞酸鈉反應制成金-銀合金納米溶膠.具體步驟如下：將總濃度為0.5 mmol/L的硝酸銀和氯金酸混合溶液100 mL(通過改變加入硝酸銀和氯金酸溶液的體積比控制金的摩爾分數分別為0.5和0.7)在微波爐中加熱至沸騰, 然后加入2 mL質量分數為1%的枸櫞酸鈉溶液，放在磁力攪拌器上保持沸騰60 min后攪拌至室溫，得到的金-銀合金納米溶膠.

1.2.2小鼠血清的制備 在麻醉狀態(tài)下抽取活體小鼠血液，不加抗凝劑，靜置1 h后，以轉速3 000 r/min離心10 min去除紅細胞，取淡黃色上清液得到小鼠血清.

1.2.3拉曼光譜的測量 將制備的金屬溶膠與樣品血清按體積比1∶1等量混合后放在樣品池中, 激發(fā)光源為氦-氖激光器，波長為632.8 nm, 曝光時間10 s, 累加次數3次，采用180°背散射接收方式，400～1 800 cm-1范圍內掃描.

2 結果與討論

2.1 金屬納米溶膠的表征

SERS是基于金屬納米粒子的表面等離子體共振現(xiàn)象, 在納米級尺度上粒子粗糙表面的電磁場會得到極大增強.在SERS中，納米粒子的形貌、尺寸大小和組成決定著納米粒子的光學特性和SERS增強效應.

a：銀納米溶膠； b：金-銀合金(金0.5)納米溶膠； c：金-銀合金(金0.7)納米溶膠； d：金納米溶膠圖1 金屬納米溶膠的紫外-可見吸收光譜Fig．1 UV-Vis absorption spectra of metal nano sols

2.1.1紫外光譜表征 圖1為金屬納米溶膠的紫外-可見吸收光譜.根據紫外-可見吸收光譜的表面等離子體吸收峰(SPR)的位置和形狀，可以判斷納米粒子的形狀和粒徑分布[7].從圖1中可以看出，銀納米溶膠的吸收峰在390 nm，吸收峰向長波方向展寬，表明銀納米粒子尺寸分布較寬，溶液中有不規(guī)則的粒子存在.金納米溶膠紫外吸收光譜在520 nm處有1個吸收峰, 峰的寬度較寬，表明制得的金納米顆粒的粒徑不均勻.金-銀合金納米溶膠的紫外吸收光譜只有1個吸收峰，位于金納米溶膠和銀納米溶膠的最大吸收峰之間，2種由不同金銀比例制備的合金納米粒子的SPR分別在480、502 nm處，表明合金納米粒子的SPR具有可調性，隨著金所占比例的增加，金-銀合金納米溶膠的離子共振吸收峰發(fā)生紅移.因為合金納米粒子的SPR具有可調性，所以可以通過調整金含量的比例改變SPR的頻率，實現(xiàn)與不同頻率激發(fā)光的耦合.

2.1.2透射電鏡表征 圖2為金屬納米溶膠的透射電鏡(TEM)圖.TEM結果顯示，銀納米粒子(圖2a)的形狀基本呈球形，有少量的棒狀顆粒，粒徑相差較大，出現(xiàn)直徑為20～60 nm的不同粒徑大小的顆粒.金-銀合金納米粒子(圖2b和圖2c)基本是球形結構，粒徑約為40 nm，粒子大小比較均勻、分散性好，粒子之間存在著能增強SERS效應的“熱點”.金納米粒子(圖2d)呈球形，粒徑20 nm左右，粒子大小不均勻、分散性不好，出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，并且粒子之間缺少能提高SERS強度的“熱點”，影響其SERS的增強效應.

a: 銀納米溶膠； b:金-銀合金(金0.5)納米溶膠； c:金-銀合金(金0.7)納米溶膠； d:金納米溶膠圖2 金屬納米溶膠的透射電鏡圖Fig．2 TEM images of metal nano sols

a: 金-銀合金(金0.5)納米溶膠； b: 銀納米溶膠； c: 金納米溶膠； d:無基底圖3 小鼠血清的普通拉曼光譜和表面增強拉曼光譜Fig．3 Normal Raman spectra and surface-enhanced Raman spectra of mice serum

2.2金屬納米溶膠對小鼠血清SERS增強效應的比較

所用的3種金屬溶膠中，金納米溶膠具有很好的生物兼容性，銀納米溶膠具有很高的穩(wěn)定性，兩種溶膠是SERS中常見的基底.金-銀合金納米溶膠的SPR有可調性，具有獨特的光學性質，是近些年備受關注的基底.因為小鼠與人類有很多相近的基因，本實驗采用正常小鼠的血清作為生物樣品, 以金納米膠、銀納米膠和金-銀合金(金0.5)納米溶膠為基底，測得小鼠血清的SERS，比較3種金屬納米溶膠對血清SERS的增強效果.圖3為小鼠血清的普通拉曼光譜和3種金屬溶膠基底血清的SERS.

小鼠血清的SERS是由白蛋白和各類球蛋白質分子中肽鍵引起不同類型的特征振動、主鏈骨架C—C和C—N振動和側鏈構象的振動，以及蛋白質空間二級結構中的α螺旋、β折疊和酰胺Ⅰ-Ⅶ等組成[8].從譜峰指認可知，621、1 015、 1 146 cm-1是蛋白質結構主鏈骨架的振動峰.1 224、1 315、1 687 cm-1歸屬于血清蛋白酰胺鍵，屬于蛋白質二級結構.1 003、1 636 cm-1是蛋白質的側鏈苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)的貢獻，在光譜中屬于強峰.652、958、1 352、1 547 cm-1是酪氨酸和色氨酸的特征峰.在小鼠血清SERS中還包括少量糖類和脂類，其中527 cm-1是碳水化合物D-甘露醇的特征峰，1 469 cm-1屬于脂類特征峰.

從圖3可以看出，以金-銀合金納米溶膠(圖3a)為基底的SERS譜峰在527、958、1 003、1 146、1 352、1 469 cm-1處信號增強明顯，表明以金-銀合金納米溶膠為基底測得的血清SERS，不僅能夠較準確地反映血清中蛋白質的結構，還能夠獲得血清中含量非常低的糖和脂類的信息.以銀納米溶膠(圖3b)為基底的SERS譜峰也有一定的增強，958、1 003、1 146、1 352、1 636 cm-1譜峰較強，但是在527 cm-1處只有一小峰，未見1 469 cm-1峰，說明以銀納米溶膠為基底的SERS可以用于血清蛋白質結構的主鏈、側鏈和二級結構的測定，但是對脂類和糖的測定效果較差.以金納米溶膠(圖3c)為基底的SERS譜峰也得到增強，但增強幅度較小.在1 003、1 146、1 352、1 636 cm-1處信號得到加強，但在1 224、1 315、1 687 cm-1處峰強較弱， 527、1 469、1 547 cm-1峰消失，表明金納米溶膠的SERS活性比銀納米溶膠差，可能是銀納米溶膠在可見光范圍表面增強因子好于金納米溶膠的緣故.

圖3顯示所有金屬納米溶膠對血清SERS均有增強，但增強效果不同.金納米溶膠對血清SERS的增強效果較弱，這是由于金納米顆粒粒徑較小，無法吸附血清分子而形成良好的單分子吸附層，所以產生的表面等離子體共振效應也較弱[1]，此外，可能是由于金納米粒子不均勻，出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，影響SERS增強效果.銀納米溶膠對血清的增強效果比金納米溶膠強，可能是由于激發(fā)光波長對銀納米溶膠比金納米溶膠靈敏[2].金-銀合金納米溶膠對血清SERS的增強效果好于銀納米溶膠，主要峰都得到增強，這是因為金-銀合金納米溶膠粒徑適中，血清分子吸附在其上能夠形成較好的單分子吸附層，從而形成強烈的表面等離子共振.而銀納米顆粒粒徑較大，雖然理論上能夠吸附更多的血清分子，但同時粒子間斥力也會增大[3]，所以表面等離子體共振效應比金-銀合金納米溶膠弱.金-銀合金納米溶膠既有金納米溶膠生物兼容性好的特點，又有銀納米溶膠高穩(wěn)定性的特點，從而使SERS得到最大的增強.因此，金-銀合金納米溶膠是檢測小鼠血清比較理想的基底.

3 結論

比較了金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠對小鼠血清SERS的活性，結果表明，3種金屬溶膠都具有一定的SERS增強效應.從透射電鏡圖可以看出，金-銀合金納米溶膠為球形結構，粒徑約為40 nm，粒子大小均勻，存在能提高SERS強度的“熱點”，極大地增強了合金納米粒子的局域電磁場強度，SERS強度得到提高.銀納米溶膠的粒子大小約為50 nm，粒徑分布不是很理想，納米粒子之間的距離大于2 nm，所以能增強SERS光譜的“熱點”不多.金納米溶膠粒徑在20 nm左右，有團聚現(xiàn)象出現(xiàn)，影響其SERS增強效應.以金-銀納米溶膠為基底測得的血清SERS，能夠較準確地反映血清分子的微觀結構.以銀納米溶膠為基底的血清SERS光譜可以用于血清蛋白質結構的主鏈、側鏈和二級結構的測定，但是對脂類和糖的測定效果較差.以金納米溶膠為基底的血清SERS峰強相對較弱，而且沒有檢測到脂類和糖.實驗結果表明，金-銀合金納米溶膠的SERS活性最強，銀納米溶膠其次，金納米溶膠最差.

[1] BRUST M, WALKER M, BETHELL D, et al.Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system[J]. J Chem Soc Chem Commun, 1994(7): 801-802.

[2] 高宇,崔顏,向娟,等.脫金屬硫蛋白吸附在粗糙金表面的表面增強拉曼光譜[J].光散射學報, 2008,20 (2):173-177.

[3] WILIETS K A.Surface-enhanced Raman scattering (SERS) for probing internal cellular structure and dynamics[J].Anal Bioanal Chem, 2009, 394(1): 85-94.

[4] FLEISCHMANN M, HENDRA P J, MCQUILLAN A J. Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode [J]. Chem Phys Lett, 1974, 26 (2): 163-166.

[5] LEE P C, MEISEL D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols [J]. J Phys Chem, 1982, 86 (17): 3391-3395.

[6] JANA N R, GEARHEART L, MURPHY C J, et al. Wet chemical synthesis of high aspect ratio cylindrical gold nanorods[J].Phys Chem B, 2001, 105(19):4065-4067.

[7] 金毅亮，秦維，蔣蕓，等. 金銀合金納米粒子表面處理及其表面增強拉曼光譜研究[J].化學學報,2008, 66(22):2494-2498.

[8] MALLIN M P, MURPHY C J. Solution-phase synthesis of sub-10 nm Au-Ag alloy nanoparticles[J]. Nano Lett, 2002, 2(11): 1235-1237.

(責任編輯：孔 薇)

TheEnhancementEffectsinSurface-enhancedRamanSpectroscopyofMiceSerumwithDifferentMetalNanoSols

LIU Jian1, HAO Qianyun2, LIU Wanhua3, DIAO Zhengqi3, TANG Weiyue3

(1.SchoolofInformationEngineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.People’sHospital,PekingUniversity，Beijing100045,China; 3.SchoolofPhysicalEngineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) in mice serum was determined with the gold, silver and Au-Ag alloy nano sol as substrates. The characteristic peaks at 958,1 003,1 015,1 146,1 352 cm-1which assigned to the main chain, side chain and secondary structure of serum protein were observed. And the vibrating peaks observed at 527, 1 469 cm-1were the characteristic peaks of small amount of carbohydrate D-mannitol and lipid in serum. Moreover, the SERS enhancement effects of three kinds of metal sol substrate were compared. The results indicated that SERS peaks were enhanced by using Au-Ag alloy nano sol as substrate. Especially,the characteristic peaks were enhanced significantly at 527,958,1 003,1 146,1 352, 1 469 cm-1.When using silver nano sol as substrate, the SERS characteristic peaks of protein structure had certain enhancement. But merely there was a small peak at 527 cm-1, the peak of 1 469 cm-1was invisible. When using gold nano sol as substrate, the characteristic peaks of protein structure were also strengthened, but the peaks at 527,1 469, 1 547 cm-1were disappeared. The results showed that the SERS activity of Au-Ag alloy nano sol was the strongest, silver nano sol was moderate, and gold nano sol was the weakest.

metal nano sol; surface-enhanced Raman spectroscopy; serum; mice

2017-07-10

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(152300410029)；河南省科技攻關計劃項目(162102210009).

劉健(1968—)，男，河南鄭州人，講師，主要從事拉曼光譜在生物醫(yī)學方面的應用研究, E-mail: zzdxlwh@126.com.

O657.3

A

1671-6841(2017)04-0057-04