松果菊苷對db/db小鼠肝臟脂質代謝的影響

唐鳳娟+郝亞榮++張雪++秦建

[摘要] 目的 探討松果菊苷（ECH）對db/db小鼠肝臟脂質代謝的影響及其作用機制。 方法 采用隨機數字表法將21只8周齡體重40～48 g的健康雄性db/db小鼠分為db/db+ECH組[n = 11，ECH灌胃300 mg/（kg·d）]和db/db組（n = 10，給予相應體積的生理鹽水灌胃）。以同窩出生的db/m小鼠為正常對照組，即db/m組（n = 9，給予相應體積的生理鹽水灌胃）。每周檢測小鼠的體重。連續干預10周后處死小鼠，留取肝臟組織標本，檢測小鼠肝濕重、睪丸周圍脂肪重量，提取肝臟總RNA用實時定量PCR檢測三組小鼠肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）和脂肪酸氧化的限速酶肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1（CPT-1）的mRNA表達水平，肝組織蘇木精-伊紅（HE）、油紅O染色評價病理學變化。處死三組小鼠前1 d禁食12 h后經眼眶后取血，利用全自動生化檢測儀檢測谷丙轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。 結果 與db/m組比較，db/db組小鼠體重、肝濕重、睪丸周圍脂肪重量增加，血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C升高，HDL-C降低（P < 0.05或P < 0.01），肝臟組織中肝細胞腫脹，空泡變性，大量的脂質沉積；ECH干預后可降低db/db小鼠體重，肝濕重及睪丸周圍脂肪重量，也可以降低db/db小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平（P < 0.05或P < 0.01），改善肝組織病理改變和脂質沉積情況，上調肝臟組織PPAR-α和CPT-1表達（P < 0.05）。 結論 ECH對db/db小鼠肝臟具有保護作用，其機制可能與上調肝臟組織中PPAR-α和CPT-1表達從而改善脂質代謝有關。

[關鍵詞] 非酒精性脂肪肝；db/db小鼠；松果菊苷；過氧化物酶體增殖物激活受體α

[中圖分類號] RR285.5；R589.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0019-05

Effects of echinacoside on liver lipid metabolism in db/db mice

TANG Fengjuan1 HAO Yarong1 ZHANG Xue1 QIN Jian2

1.Department of Geriatrics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Central Laboratory， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of echinacoside （ECH） on liver lipid metabolism in db/db mice and its mechanism. Methods Twenty-one healthy male db/db mice aged 8 weeks and weighing from 40 to 48 g were divided into db/db+ECH group [n = 11， ECH， 300 mg/（kg·d）] and db/db group （n = 10， given the corresponding volume of saline） by random number table， db/m mice born with same littermates were served as normal control group， that was db/m group （n = 9， given corresponding volume of normal saline）. The weight of the mice was measured weekly. The mice were sacrificed 10 weeks after the intervention. The liver tissues were sacrificed and the wet weight of the liver and the weight of the fat around the testes were measured. The total RNA of the liver was extracted and the mRNA of peroxisome proliferator-activated receptor α （PPAR-α） and carnitine palmitoyl transterase-1 （CPT-1） were detected by real-time quantitative PCR. Liver tissue hematoxylin-eosin （HE）， oil red O staining were used to evaluate pathologic changes. The levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate transaminase （AST）， triglyceride （TG）， serum total cholesterol （TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） were measured by automatic biochemical analyzer after fasting for 12 hours and 1 d before the rats were sacrificed. Results Compared with db/m group， the body weight， wet weight of liver and testicular fat around the weight in the db/db group were increased， and the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C in serum were increased and HDL-C in serum was decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， liver tissue showed liver cell swelling， vacuolar degeneration， a lot of lipid deposition； ECH intervention could reduce body weight， liver wet weight and testicular fat around the weight of db/db mice， decrease the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C and increase the level of HDL-C （P < 0.05 or P < 0.01）， improve the pathological changes of liver tissue and lipid deposition， and up-regulate the expression of PPAR-α and CPT-1 in liver tissue （P < 0.05）. Conclusion Echinacoside has protective effect on liver of db/db mice， and its mechanism may be related to up-regulating the expression of PPAR-α and CPT-1 in liver tissue and improving lipid metabolism.endprint

[Key words] Nonalcoholic fatty liver disease； db/db mice； Echinacoside； Peroxisome proliferator-activated receptor α

非酒精性脂肪性肝病是除酒精和其他明確損肝因素所致的以肝實質細胞脂肪堆積為主要特征的一系列疾病，包括肝細胞的脂肪沉積、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化[1]。近年來隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病已成為最常見的慢性肝病，非酒精性脂肪性肝病也是肝硬化與肝癌發生的一個重要原因[2-3]。非酒精性脂肪性肝病的有效防治可阻止和改善疾病的進程及預后。但對于該病至今尚缺乏有效的治療方法，因此，非酒精性脂肪性肝病早期的發現、診斷和預防工作顯得尤為重要。

目前為止，非酒精性脂肪肝尚無理想的治療藥物，臨床上主要使用調血脂藥如他汀類對其進行治療，但其一方面毒副作用明顯，另一方面會加重脂質在肝臟中的沉積，容易引起和加重肝損傷。因此，近年來從植物資源中尋找高效、安全的天然產物來改善和治療非酒精性脂肪性肝病及代謝綜合征已成為研究的一大熱點。松果菊苷（echinacoside，ECH）是從管花肉蓯蓉根部提取分離得到，為管花肉蓯蓉的活性部位蓯蓉總苷中含量最高的苯乙醇苷類化合物[4]。近年，ECH在對保護肝臟、抗炎的藥理作用已得到證實[5-6]。但鮮有關于ECH抗非酒精性脂肪性肝病的藥理作用及其機制研究。本研究通過給予db/db小鼠ECH治療，觀察ECH對db/db小鼠脂質代謝的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

遺傳背景為C57BLKS/J的雄性db/db小鼠和db/m小鼠由南京大學-南京生物醫藥研究院提供[SCXK（蘇）2015-0001]，分籠飼養于武漢大學人民醫院動物中心（SPF級），每籠4～5只，室溫18～24℃，相對濕度60%，每日光照12 h，實驗期間自由攝食、飲水，喂養普通飼料，不運用任何降糖藥物。

1.2 儀器與試劑

電子天平（METTER TOLEDO公司）；全自動顯微鏡BX63（日本Olympus公司）；基因擴增儀（美國ABI公司）；實時熒光定量PCR檢測儀（7500序列檢測系統）（美國ABI公司）；全自動生化檢測儀AU2700、Image Pro Plus圖像分析系統。

ECH（上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號150623）、4%多聚甲醛（谷歌生物科技有限公司，批號WB1101）、TRIZOL試劑（美國Invitrogen公司，批號15596-026）；油紅O染液（上海晶都生物技術有限公司，批號JD-0699）；蘇木精染液（深圳市康初源有限公司，批號H1328）；伊紅染液（北京索萊寶科技有限公司，批號G11002）；RT-PCR逆轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號047A）；熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司，批號820A）。

1.3 實驗動物分組

同窩出生6周齡小鼠經檢疫1周及適應飼養1周。隨機編號將db/db小鼠分為兩組：令1～10號為糖尿病對照組（db/db組，n = 10），11～21號為ECH治療組（db/db+ECH組，n = 11）。選取db/m小鼠9只作為正常對照組（db/m組，n = 9），于8周齡時分別作如下干預：db/m組和db/db組每日按照0.05 mL/10 g體重進行生理鹽水灌胃10周。db/db+ECH組按松果菊300 mg/（kg·d）灌胃，共10周。每周檢測三組小鼠體重，觀察小鼠的攝食、飲水以及活動等情況。干預10周后用2%戊巴比妥鈉0.1 mL/10 g體重腹腔注射麻醉小鼠，眼眶后采血，迅速分離血清，于-80℃冰箱保存待測。心臟灌流后，分離小鼠肝臟，稱取肝臟濕重、腹部及睪丸周圍脂肪重量。留取肝臟組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于做石蠟切片病理檢查，一部分新鮮組織做冰凍切邊后用于油紅O染色，剩余的肝臟組織置于液氮1 h后保存在-80℃，用于實時熒光定量PCR。

1.4 小鼠的一般情況

觀察并記錄實驗期間小鼠的攝食、飲水、體重、行為和皮毛等一般情況。

1.5 肝功能與血脂水平

用全自動生化檢測儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 肝臟HE染色和油紅O染色

HE染色：處死小鼠后立即分離肝臟，4%多聚甲醛中固定24 h后，脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，進行HE染色，在200×光鏡下觀察肝組織脂肪變及炎癥情況，并行NASH評分。評分標準參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[7]制訂的標準。油紅O染色：肝臟組織有OCT包埋后，行冰凍切片，切片厚度為5 μm。用60%異丙醇洗后再水洗，然后采用油紅O工作液染色1 min，60%異丙醇分化30 s，水洗后以蘇木精染色30 s，水洗至顯微鏡下觀察清晰顏色，風干后用中性樹脂封片。

1.7 RT-PCR檢測

取各組小鼠肝臟組織100 mg，Trizol法提取總RNA。逆轉錄成cDNA后用SYBR Green擴增cDNA，每個樣本加入3個復孔。擴增條件：①預變性95℃ 30 s；②PCR反應95℃ 5 s、60℃ 40 s，總共40個循環；③溶解95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。選取管家基因β-actin作為內參照，使用ABI7500軟件2-△△CT法處理數據[8]，引物序列見表1。

1.8 統計學方法

研究數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 小鼠的一般情況及ECH對小鼠體重、肝濕重以及睪丸周圍脂肪重量的影響

實驗過程中db/m組小鼠攝食與飲水正常，皮毛光滑。與db/m組比較，db/db組和db/db+ECH組小鼠水與食物攝入量增加，活動度降低，皮毛顏色變黑。db/db組小鼠在第8周時體重是db/m組小鼠的近2倍[（43.34±1.70）g比（21.51±1.71）g，P < 0.01]。干預10周后，db/db組小鼠體重明顯高于db/m組（P < 0.01），而db/db+ECH組小鼠體重較db/db組明顯下降（P < 0.01）（圖1）。三組小鼠干預10周后肝臟濕重、睪丸周圍脂肪重量差異有高度統計學意義（P < 0.01），與db/m組比較，db/db組小鼠肝臟濕重、睪丸周圍脂肪重量明顯升高（P < 0.01），與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠肝臟濕重、睪丸周圍脂肪明顯下降（P < 0.05）（表2）。實驗過程中ECH治療組小鼠死亡1只（被咬死）。

與db/m組比較，**P < 0.01；與db/db組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；ECH：松果菊苷

圖1 ECH對db/db小鼠體重的影響

2.2 ECH對db/db小鼠血脂水平以及肝功能的影響

與db/m組比較，db/db組小鼠TC、TG、LDL、ALT、AST和明顯升高（P < 0.05），而HDL-C明顯降低（P < 0.01）。與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠TC、TG、ALT、AST明顯降低（P < 0.01），HDL-C顯著升高（P < 0.01）（圖2）。

2.3 ECH對db/db小鼠肝臟形態學的影響

HE染色顯示，db/m組小鼠肝組織染色正常，肝細胞排列整齊，胞漿分布均勻。db/db組肝細胞體積增大，表現為腫脹和大小不等的脂滴。中肝葉是可見炎性細胞浸潤的，在肝門區有病灶性壞死，非酒精性脂肪性肝病活動度評分3～7分，60%達到非酒精性脂肪性肝炎的診斷標準（圖3A）。與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠肝細胞體積減小，細胞內脂滴減少，炎性浸潤減輕（圖3A）。油紅染色顯示，db/m組小鼠肝細胞脂滴少，無脂質變性。db/db組小鼠肝細胞發生嚴重脂質變性，觀察到不同大小的脂質空泡，在門靜脈竇區有顯著意義。經ECH治療后小鼠肝細胞內脂質沉積明顯減輕（P < 0.01，圖3B）。

2.4 ECH對db/db小鼠肝臟組織中PPAR-α和CPT-1的mRNA表達水平的影響

應用Takara RT-PCR反應體系進行mRNA定量檢測發現：db/db組小鼠肝臟組織PPAR-α和CPT-1水平顯著低于db/m組小鼠（P < 0.01）；經ECH治療10周后，小鼠肝臟組織PPAR-α和CPT-1表達水平較db/db組明顯升高（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病是代謝綜合征的肝臟表現，與肥胖、高脂血癥、2型糖尿病等多種因素密切相關[9]。非酒精性脂肪性肝病與高尿酸血癥以及痛風也密切相關[10]。本研究所研究的動物db/db小鼠是由于在瘦素受體基因中發生異常的剪接導致瘦素受體發生缺失突變而產生肥胖、高血糖、高胰島素、脂肪肝等表現，常用于非酒精性脂肪性肝病的實驗研究[11]。

本研究利用ECH給予db/db小鼠灌胃治療，觀察ECH對糖尿病小鼠肝脂質代謝的影響，結果顯示，db/db組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST顯著高于db/m組，血清HDL-C顯著低于db/m組；病理檢查顯示，db/db組小鼠肝臟組織出現細胞腫脹、空泡變性、脂質沉積和炎癥細胞浸潤。與db/db組小鼠比較，db/db+ECH組小鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST顯著降低，血清HDL-C顯著升高，并且病理檢查顯示db/db+ECH組肝細胞空泡細胞數目明顯減少，胞質含脂肪滴減少，脂肪肝得到明顯的改善，證實ECH能減輕db/db肝臟脂肪變性，對db/db小鼠肝臟具有保護作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）在非酒精性脂肪性肝病的發病機制中占有重要地位[12]。PPAR-α活化后促進脂質代謝的主要機制有：調控很多線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化的很多關鍵酶，如CPT-1等[13]；促進長鏈、支鏈脂肪酸氧化[14]；活化后調節脂蛋白的合成和組裝，減少極低密度脂蛋白的量[15]；活化后間接調節膽汁酸的合成，促進膽固醇排泄[16]；活化后可抑制炎癥基因的表達。有研究發現，在非酒精性脂肪性肝病患者或是長期過度攝食富含大量脂類食物的動物模型中，PPAR-α在肝臟的表達顯著降低[17-18]。Everett等[19]在用PPAR-α基因敲出鼠模型研究發現，其肝臟游離脂肪酸含量顯著增多，脂質代謝明顯紊亂，肝臟出現明顯的脂肪變性。這些發現都說明PPAR-α在非酒精性脂肪性肝病的發病機制中發揮了重要作用。CPT-1是脂肪酸β氧化中的限速酶，在脂肪肝病中起著非常重要的作用[20]。本研究結果顯示，db/db組小鼠肝臟組織中PPAR-α、CPT-1 mRNA水平較db/m組明顯降低；在db/db+ECH組小鼠肝臟組織中PPAR-α、CPT-1 mRNA水平較db/db組顯著升高，說明ECH可以調節TG和TC的生物合成和吸收，影響db/db小鼠的脂質代謝，并通過調節肝臟脂質代謝關鍵酶的表達水平來保護肝臟功能。

綜上所述，本研究表明ECH對db/db小鼠的肝功能具有保護作用，其機制可能與上調肝臟組織中PPAR-α和CPT-1表達從而改善脂質代謝有關。

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（收稿日期：2017-06-23 本文編輯：張瑜杰）endprint