尖吻蝮蛇出血毒素Ⅰ與小鼠血管壁靶蛋白結(jié)合的研究

韋傳寶，鄧 輝

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，安徽 六安 237012)

尖吻蝮蛇出血毒素Ⅰ與小鼠血管壁靶蛋白結(jié)合的研究

韋傳寶1,2，鄧 輝1

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，安徽 六安 237012)

為了檢測(cè)小鼠血管壁上是否含有與尖吻蝮蛇出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)結(jié)合的靶蛋白，按照前人的方法純化出血毒素Ⅰ，制備其抗血清，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)動(dòng)物血管壁上是否含有與尖吻蝮蛇AaH Ⅰ結(jié)合的靶蛋白。顯微鏡觀察表明，血管壁出現(xiàn)顯色環(huán)，說(shuō)明尖吻蝮蛇AaH Ⅰ與血管壁上的某種蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。因此，小鼠血管壁上存在結(jié)合尖吻蝮蛇AaH Ⅰ的靶蛋白，尖吻蝮蛇AaH Ⅰ進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)先結(jié)合靶蛋白，然后進(jìn)一步引起出血。

尖吻蝮蛇；出血毒素Ⅰ；靶蛋白；免疫組織化學(xué)檢測(cè)

尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus) 是我國(guó)特有蛇種，分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)(包括臺(tái)灣)，劇毒。該蛇為血循環(huán)型毒蛇，咬傷后傷口和內(nèi)臟大量出血，致死、致殘率極高。

前人從不同產(chǎn)地的尖吻蝮蛇毒中分離出多種出血毒素。徐詢等[1]最先從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中分離出3種低分子量出血毒素，分別命名為出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)、出血毒素Ⅱ(AaH Ⅱ)和出血毒素Ⅲ(AaH Ⅲ)；隨后朱中良等[2]從皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒中純化出1種中等分子量的出血毒素，命名為出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。

對(duì)尖吻蝮蛇出血毒素分離和性質(zhì)方面的研究較為深入，但對(duì)出血機(jī)制的研究很少，一直未有實(shí)質(zhì)性的突破。何華平等[3]用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記AaH Ⅰ，研究得出毛細(xì)血管內(nèi)壁上可能存在AaH Ⅰ的靶蛋白的結(jié)果。韋傳寶等[4]研究125I-AaH Ⅰ和腎毛細(xì)血管組織的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)125I-AaH I和家兔腎毛細(xì)血管組織的結(jié)合具有時(shí)間飽和性、濃度飽和性，未標(biāo)記AaH I與125I-AaH I有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特性，pH低于5.8或高于8.0時(shí)結(jié)合能力下降，這些特性間接證明血管壁可能有AaH I靶蛋白存在。本研究先分離純化AaH Ⅰ，制備其抗血清，然后用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)動(dòng)物血管壁上是否含有與尖吻蝮蛇AaH Ⅰ結(jié)合的靶蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

尖吻蝮蛇毒購(gòu)自安徽省祁門縣祁門蛇傷研究所；羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(美國(guó)LKB公司)、層析柜(上海分析儀器廠)、冷凍切片機(jī)(德國(guó)Micr0公司)、顯微鏡(江南儀器廠)等。

1.2 AaH Ⅰ的純化

按照徐詢等[1]的方法純化AaH Ⅰ，用12% SDS-PAGE測(cè)定其純度。合格的AaH Ⅰ冷凍備用。

1.3 AaH Ⅰ抗血清的制備

將純化的AaH Ⅰ加少量的Na2EDTA抑制其出血活性，然后加佐劑乳化，按照常規(guī)方法免疫動(dòng)物制備抗血清。

1.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)AaH Ⅰ靶蛋白

按照常規(guī)的免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行[5]，大致過(guò)程如下：(1)處死1只小鼠，解剖取大腿肌肉組織，用手術(shù)刀切成黃豆大小的組織塊用生理鹽水洗去血液備用；(2)冷凍切片。切片厚度0.1 nm,將切片組織粘貼到處理過(guò)的載玻片上；(3)進(jìn)行組織免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)：封閉、加AaH Ⅰ結(jié)合靶蛋白、加AaH Ⅰ抗血清結(jié)合AaH Ⅰ、加二抗結(jié)合一抗IgG、顯色、脫水封片、顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 AaH Ⅰ的純化與抗血清的制備

按照徐詢等的方法成功純化出AaH Ⅰ，12% SDS-PAGE檢測(cè)純度合格。并成功地制備出抗血清?？寡迥軌蛑泻虯aH Ⅰ的出血活性，說(shuō)明抗血清含能夠結(jié)合AaHⅠ的IgG,因此符合免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)方法鏡檢結(jié)果如圖1。從圖中可以看出，小鼠肌肉血管壁上出現(xiàn)明顯的色素聚集，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，說(shuō)明小鼠血管壁上有AaH Ⅰ的靶蛋白。靶蛋白存在的情況下，AaH Ⅰ與靶蛋白結(jié)合后又結(jié)合抗AaH Ⅰ血清中的IgG。IgG與二抗結(jié)合，二抗IgG共價(jià)結(jié)合了堿性磷酸酶，堿性磷酸酶水解顯色底物產(chǎn)生顏色，即血管壁周圍的顏色。如果沒(méi)有靶蛋白，AaH Ⅰ不與血管壁結(jié)合，抗AaH Ⅰ血清中的IgG也不會(huì)結(jié)合到血管壁上，共價(jià)結(jié)合了堿性磷酸酶的二抗也不會(huì)結(jié)合到血管壁上，底物在沒(méi)有堿性磷酸酶的情況下不會(huì)產(chǎn)生色素，血管壁周圍沒(méi)有色素沉積。

圖1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)AaH Ⅰ靶蛋白的鏡檢結(jié)果(血管壁周圍顯示有色素沉積)

3 結(jié)果

小鼠血管壁上存在結(jié)合尖吻蝮蛇AaH Ⅰ的靶蛋白，尖吻蝮蛇AaH Ⅰ進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)先結(jié)合靶蛋白，然后進(jìn)一步引起出血。

4 討論

對(duì)毒蛇神經(jīng)毒素的受體及其作用機(jī)制研究比較清楚，蛇毒神經(jīng)毒素結(jié)合到動(dòng)物神經(jīng)突軸(或神經(jīng)-肌肉結(jié)合部)的特異受體上，抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。目前，對(duì)出血機(jī)制的研究報(bào)道大多與人體病理有關(guān)[6-8]，對(duì)動(dòng)物出血毒素出血機(jī)制的詳細(xì)研究未見(jiàn)報(bào)道。蛇毒出血毒素通過(guò)直接破壞血管壁基底膜而出血，如何破壞血管壁基底膜的尚處于推測(cè)和假說(shuō)階段，關(guān)鍵問(wèn)題是不知道血管壁上是否有出血毒素的靶蛋白，更不知道靶蛋白的性質(zhì)，本研究目的是確認(rèn)動(dòng)物血管壁上是否存在尖吻蝮蛇出血毒素的靶蛋白，其研究結(jié)果與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[3，4]，傾向于推測(cè)動(dòng)物血管壁上有與尖吻蝮蛇出血毒素結(jié)合的靶蛋白存在。這種推測(cè)是否真實(shí)，還需要進(jìn)行靶蛋白的分離和鑒定，只有分離出靶蛋白才能夠?qū)⑼茰y(cè)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，分離靶蛋白也是我們今后工作的一個(gè)努力方向，只有解決了這個(gè)問(wèn)題，與出血機(jī)制相關(guān)的問(wèn)題才能獲得解決。

[1]Xu X，Wang C，Liu J，et al. Purification and Characterization of Hemorrhagic Components fromAgkistrodonAcutus(Hundred Pace Snake) Venom[J].Toxicon, 1981,19(5):633-644.

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[3]何華平，王玉珍，徐詢.酶標(biāo)法觀察尖吻蝮出血毒素Ⅰ對(duì)毛細(xì)血管的作用[J].動(dòng)物學(xué)研究，1988(9)：99-101.

[4]韋傳寶，胡健饒，許寧一.尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)毒出血毒素Ⅰ出血機(jī)制的研究[J].科技通報(bào)，2003，19(2)：154-158.

[5]徐宜為.免疫檢測(cè)技術(shù)[M].第3版.北京：科學(xué)出版社，1991.

[6]Guohua Xi, Richard F. Keep. Intracerebral Hemorrhage: Mechanisms and Therapies [J].Translational Stroke Research, 2012, 3(1):1-3.

[7]P. Bouz, A. Zouros, A. Taha, V. Sadanand. Neonatal Intracerebral Hemorrhage: Mechanisms, Managements, and the Outcomes[J].Translational Stroke Research, 2012, 3(1):6-9.

[8]Josephine Lok, Wendy Leung, Sarah Murphy,et al. Intracranial Hemorrhage: Mechanisms of Secondary Brain Injury[J]. Acta Neurochirurgica Supplementum, 2011, 111: 63-69.

StudiesonCombinationbetweenTargetProteinonMouseVascularWallandHemorrhaginIfromAgkistrodonacutusVenom

WEI Chuanbao1,2，DENG Hui1

(1.BiologicalandPharmaceuticalEngineeringCollege,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China; 2.AntibodyPreparationandPropertyTestReseachCenter,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China)

Objective: Determine whether there is target protein to Hemorrhagin I (AaH Ⅰ) fromAgkistrodonacutusvenom on mouse vascular wall. Methods: AaH Ⅰwas purified according to predecessor’s method and its antiserum was prepared. The target protein to AaH Ⅰon mouse vascular wall was tested by immunohistochemistry test. Results: By microscopic examination, chromatic circle show on mouse vascular wall. The results indicated that there is target protein to AaH Ⅰ on mouse vascular wall. Conclusion: There is target protein to AaH Ⅰ on mouse vascular wall. After AaH Ⅰ entering animal body it first combines target protein and then it induces hemorrhage.

Agkistrodonacutus; AaH Ⅰ; target protein; immunohistochemistry

R991

A

1009-9735(2017)05-0099-04

2016-11-05

安徽自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC43)；安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A454，KJ2013A264)。

韋傳寶(1961-)，男，安徽壽縣人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蛇毒蛋白。