不同光照處理對霍山石斛多酚含量積累的影響

陳傳平，陳乃東，劉國瑞

(1.皖西衛生職業學院，安徽 六安 237005；2.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

不同光照處理對霍山石斛多酚含量積累的影響

陳傳平1，陳乃東2，劉國瑞2

(1.皖西衛生職業學院，安徽 六安 237005；2.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

為探究不同光照處理對霍山石斛根、莖和葉中多酚的含量及種類的影響，分別采用紅藍光照和模擬自然光照處理霍山石斛根、莖和葉，用比色法測定其不同光照條件處理下的多酚含量，運用毛細管電泳儀，通過沉淀敲除法和制得的樣品進行對照檢測多酚種類。研究表明，霍山石斛根、莖和葉多酚含量依次增多，紅藍光照處理根、莖和葉各部分多酚含量比模擬自然光照處理的少，但多酚種類則是紅藍光照處理的較多。因此，不同光照對霍山石斛多酚的積累及種類有明顯影響。

霍山石斛；毛細管電泳；多酚；光照處理；沉淀敲除

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseTang et Cheng)，又稱米斛，主產于安徽省霍山縣等地，是蘭科石斛屬的草本植物，有生津益胃、益智除驚、輕身延年、抗腫瘤、降糖保肝和抗白內障等多種功效[1-3]。多酚(Polyphenols)是植物的主要次生代謝產物之一，為多羥基酚類化合物的總稱，有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等作用，是石斛中重要的生物活性物質之一[4-6]。

文獻檢索發現，光照條件改變可以對植物次生代謝產物的積累產生影響[7-8]。本實驗用模擬自然光、紅藍光分別處理霍山石斛，測定了其多酚的含量和種類，初步探究了光照條件與其多酚積累及種類的關系，為進一步研究霍山石斛多酚提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

兩年生霍山石斛(2016年10月采自安徽省霍山縣，品種經品種經安徽省皖西學院陳乃東博士鑒定為霍山石斛)，經盆栽4周預培養后，隨機分組置模擬自然光及紅藍光下培養。模擬自然光組，用波長460～760 nm、光強300 lux LED燈光照射；紅藍光組，用波長630 nm(紅色)、光強160 lux及波長460 nm(藍色)、光強160 lux LED燈光同時照射；兩組光照時間均為12 h/d，生長溫度25 ℃/16 ℃(日/夜)[9]，同條件水肥培養。50 d后采集洗凈、晾干，根、莖和葉分開，置電熱恒溫干燥箱中40 ℃烘至恒重，備用。

1.2 主要儀器

XPE-30、XPR-20、XPB-20型LED燈(深圳市格美芯光科技有限公司)，GJ14-DGF3006型電熱恒溫干燥箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(金壇市國華電器有限公司)；FA-1004型電子天平(上海精科天平廠)；RE-52D型旋轉蒸發器(上海浦滬儀器廠)；K1060型毛細管電泳儀(北京凱奧科技發展有限公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 主要試劑

無水乙醇(AR,上海振興化工一廠)；乙酸乙酯(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；無水三氯化鐵(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；甲酸(AR,天津博迪化工股份有限公司)；甲醇(色譜純，上海星可生化有限公司)；福林酚(MYM生物科技有限公司)；沒食子酸標準品(上海金穗生物科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 石斛中多酚的提取

烘干至恒重的霍山石斛根、莖和葉，粉碎過30目篩。

天平稱取一定量的不同方法處理的石斛根、莖和葉，置于250 mL燒瓶中，按料液比1∶15(g/mL)加80%乙醇， 80 ℃條件下冷凝回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮至適量，置于燒杯中揮去剩余乙醇，倒入容量瓶中蒸餾水定容，得總多酚提取液，4 ℃保存[10]。

1.4.2 石斛多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法測定樣品中總多酚的含量[11]。稱取沒食子酸標準品，配置成25 ug/mL的沒食子酸標準溶液。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5、3.0 mL沒食子酸標準品于10 mL容量瓶中，依次加入2.5 mL福林酚試劑，2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min內)和1.0 mL 甲醇，最后加H2O至10 mL，在黑暗中反應60 min， 517 nm處測定吸光度值(A)。以吸光度值為縱坐標(Y)，多酚含量為橫坐標(X)，繪制沒食子酸標準曲線。取1.0 mL總多酚提取液，按同樣方法測定A，用H2O作空白對照，每組測三次取平均值，根據標準曲線計算不同光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚的含量。

1.4.3 毛細管電泳法測多酚的種類

1.4.3.1 樣品預處理

分別取制備好的不同光照處過的霍山石斛根、莖和葉總多酚提取液一定量，真空干燥后，精密稱取配置成1.0 mg/mL的水溶液，用0.45 μm纖維素膜過濾備用。

1.4.3.2 毛細管電泳條件的選擇

根據文獻[12]及預實驗，選擇硼砂作為緩沖溶液，測定波長為254 nm、分離電壓15.0 KV、緩沖液pH為9以及離子濃度為0.1 mol/L作為毛細管電泳條件。

1.4.3.3 石斛多酚組分測定

將上述處理后的石斛多酚水溶液用注射器吸取放入Doff管中。毛細管電泳儀用0.3 mol/L的NaOH、H2O和緩沖液分別沖洗，預熱3～5 min，設波長為254 nm，進樣30 s，啟動毛細管電泳儀，記錄所得圖譜。

1.4.3.4 未知石斛多酚組分的沉淀敲除鑒定

精密吸取1.0 mL石斛多酚配置成的水溶液，與三氯化鐵沉淀試劑(2 mg/mL)等體積混合，搖勻，3 000 rmp離心10 min，重復三次操作獲得敲除石斛多酚組分的上清液，用0.45 μm纖維素膜過濾。同上述測定未與沉淀試劑反應的不同光照處理的霍山石斛根、莖和葉用毛細管測定圖譜方法相同，所得圖譜結果與上述測定的石斛多酚提取物水溶液含量比較，消失或面積明顯下降的峰為多酚類組分峰[13-14]。

2 結果與分析

2.1 霍山石斛多酚含量

沒食子酸標準曲線見圖1，實驗中測得的不同條件光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚含量見表1。

由表1可知：模擬自然光照和紅藍光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚含量依次增多，其中模擬自然光照處理根、莖和葉中多酚含量較高，這可能是由于光照不同影響多酚的積累。

圖1 沒食子酸標準曲線

組分用量(g)總提液(mL)吸光度(A)含量(%)紅藍光石斛根7.309500.2030.735自然光石斛根3.3139500.2420.783紅藍光石斛莖2.73881000.2170.87自然光石斛莖1.03411000.1131.58紅藍光石斛葉1.5407500.21.28自然光石斛葉0.4284500.161.47

2.2 霍山石斛多酚組成的毛細管電泳分析結果

實驗測得模擬自然光照處理霍山石斛根、莖和葉的多酚提取物HPCE分析結果見圖2～4。

圖2 自然光照霍山石斛根HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：模擬自然光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀試劑的根提取液

圖3 自然光照霍山石斛莖HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：模擬自然光照霍山石斛莖提取液；c：加沉淀試劑的莖提取

圖4 自然光照霍山石斛葉HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：加沉淀試劑的葉提取液；c：模擬自然光照霍山石斛葉提取液

由圖2可見6～8 min峰2內敲除后的峰響應、峰面積值明顯降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛根里含有1種多酚。圖3中，敲除后的峰4、5、6、7和8響應、峰面積值有所降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛莖里含有5種多酚。圖4可見敲除后的峰6、7、8、9、10、11、12和13響應、峰面積值明顯降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛莖里含有8種多酚。圖2～4比較，從峰面積來看莖中多酚含量較高，而多酚種類莖和葉中較多。

2.3 紅藍光照處理霍山石斛根、莖及葉的多酚提取物HPCE分析結果

實驗測得紅藍光照處理霍山石斛的根、莖及葉的多酚提取物HPCE分析結果見圖5～7。

圖5 紅藍光照霍山石斛根HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀試劑的葉提取液

圖6 紅藍光照霍山石斛莖HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍光照霍山石斛莖提取液；c：加沉淀試劑的莖提取液

圖7 紅藍光照霍山石斛葉HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍光照霍山石斛葉提取液；c：加沉淀試劑的葉提取液

圖5中，6～8 min時峰3、4敲除后有一個的峰的響應值和面積明顯下降，表明紅藍光照處理的霍山石斛根里含有2種多酚。圖6中，敲除后的峰8、9、10、14、15、16、17、18、19和20響應、峰面積值明顯降低，表明紅藍光照處理的霍山石斛莖里含有10種多酚。圖7可見敲除后的3、4、6、7、8、10、11、12、13、14和15響應、峰面積值明顯降低，表明紅藍光照處理的霍山石斛莖里含有11種多酚。圖5～7比較，其中根、莖和葉中有一種共有多酚(圖5峰5、圖6峰9和圖7峰11)，從峰面積來看葉中這些種多酚含量最高。

上述結果表明，模擬自然光照和紅藍光照處理的霍山石斛根、莖和葉酚種類含量與種類都有所差別，其中紅藍光照處理的霍山石斛多酚種類要多，而含量則是模擬自然光照處理的較高。

3 討論

本研究中，緩沖液pH的選擇對樣品出峰的效果有很大的影響，檢測多酚物質時緩沖液pH要大于7，但太高會引起基線不穩。出峰的時間與電壓、緩沖液濃度有關，電壓太大出峰快但峰可能會有左右肩峰，緩沖液離子濃度大會加快出峰速度但相應電流會增加。最后，出峰時間還和毛細管的長度有關，毛細管越短，出峰越快。

研究表明，霍山石斛多酚具有較強的抗氧化活性，對DPPH和ABTS自由基的清除能力較強[15]。酚類化合物是一種天然抗氧化劑，其中多酚中酚羥基結構中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結構，同時對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力，這使得多酚具有較強的抗氧化性以及清除自由基的能力，且抗氧化活性的強弱與其所含多酚類含量及種類具有較高的相關性[16]。

道地藥材霍山石斛產業化發展目前尚處于起步階段，已經制定了相關產地、種苗生產、栽培技術等標準[1-3,17]，但其在化學成分方面的鑒別和量化尚無明確標準。藥用植物有效物質的合成與累積受自身遺傳特征、自然環境、采收等多方面的影響，從而使有效物質的含量發生變化，影響到藥材的內在質量。殷培蕾等人研究表明，光照不僅影響植物中多酚的種類和生物量，還會改變抗氧化活性[18]。本研究通過Folin-Ciocalteu比色法測定樣品中總多酚的含量以及用毛細管電泳儀通過沉淀敲除的方法和制得的樣品進樣對照測定了多酚種類。結果發現霍山石斛的根、莖、葉在相同條件下出峰不同，不同光照處理的石斛相同部位峰也不太相同，模擬自然光照的霍山石斛多酚含量較紅藍光處理的要多，這可為探索霍山石斛產業化栽培條件及建立霍山石斛化學成分質量標準提供參考[19]。

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EffectofLightontheAccumulationofthePolyphenolsinDendrobiumhuoshanenseTangetChen

CHEN Chuanping1, CHEN Naidong2, LIU Guorui2

(1.WestAnhuiHeathVocationalCollege,Lu’an237005,China; 2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China)

[Objective] To investigate the effects of different light treatments on the accumulation of polyphenol in roots, stems and leaves ofDendrobiumhuoshanenseTang et Cheng, [Method] Respectively treated by red and blue light as well as imitation of natural light for 50 days, the polyphenols accumulating in the root, stems and leaves ofD.huoshanensewere analyzed by colorimetric method and high performance capillary electrophoresis combined with precipitation and knockout pretreatment. [Results] The accumulating rates of polyphenols were increased in the orders with root

Dendrobiumhuoshanense; capillary electrophoresis; polyphenols; light treatment; precipitation knockout

S567.2

A

1009-9735(2017)05-0006-04

2017-07-18

安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2015A361)；國家自然科學基金(81573536，81274021)；中國博士基金特別資助(第后9批)(2016T90559)；中國博士后研究面上項目(2014M551791)；安徽省自然基金面上項目(1608085MH221)。

陳傳平(1972-)，男，安徽廬江人，副教授，碩士研究生，研究方向：天然產物開發與利用。