人巨細胞病毒miR-UL22A的重組載體構建以及表達分析

王鴻雁， 王 博， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁晶， 柳中洋， 阮 強

(中國醫科大學附屬盛京醫院 病毒研究室，遼寧 沈陽 110004)

人巨細胞病毒miR-UL22A的重組載體構建以及表達分析

王鴻雁， 王 博， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁晶， 柳中洋， 阮 強*

(中國醫科大學附屬盛京醫院 病毒研究室，遼寧 沈陽 110004)

優化構建人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)miR-UL22A的真核表達載體；明確HCMV臨床株及實驗室株感染過程中miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達情況。擴增HCMV UL22A編碼區不同長度(975、494、209及140 bp)的序列，構建表達miR-UL22A的重組pSilencer(pS)載體，轉染人胚腎293細胞后提取總RNA；收集HCMV臨床株Han株以及實驗室株Towne株感染人胚肺成纖維細胞后6、12、24、48和72 h以及不同感染時相(即刻早期、早期、晚期)的總RNA標本；應用TaqMan頸環-實時熒光定量PCR技術檢測上述標本miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達量。成功構建了包含上述不同長度miR-UL22A編碼序列的重組載體； 側翼序列長度各為40 bp左右的pre-miRNA(即插入140 bp的編碼序列)表達成熟miRNA的效果最佳；在病毒的一個復制周期內，HCMV臨床株和實驗室株miR-UL22A的表達趨勢無明顯差異，均在感染后6 h即檢測到表達，72 h達到峰值，且在即刻早期即有miRNA的明確表達；無論是在重組載體表達狀態下還是自然感染狀態下，miR-UL22A-5p始終為miR-UL22A前體優勢表達的miRNA。結果表明，有140 bp片段miR-UL22A編碼序列的重組載體能夠高效地異源表達miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p； miR-UL22A-5p始終為miR-UL22A前體優勢表達的miRNA。為進一步研究miRNA轉錄后調控作用提供了參考。

人巨細胞病毒；miR-UL22A-5p；miR-UL22A-3p

microRNA (miRNA) 是一類含20～24個核糖核苷酸的小分子RNA家族，廣泛存在于病毒、植物以及高等哺乳動物中。近年的研究發現，miRNA通過與其靶mRNA分子的3′末端非編碼區域(3′untranslated region, 3′UTR) 結合，在病毒感染、生物個體發育以及腫瘤發生等生命活動過程中發揮重要的轉錄后調控作用[1]。……