甘薯等10種作物基因的生物信息學(xué)分析

楊冬靜,徐 振,張成玲,孫厚俊,趙永強(qiáng),謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221131)

甘薯等10種作物基因的生物信息學(xué)分析

楊冬靜,徐 振,張成玲,孫厚俊,趙永強(qiáng),謝逸萍*

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221131)

采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)甘薯等10種NAC1蛋白的氨基酸序列及其理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、疏水性或親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明:供試10種NAC1蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸;這些NAC1蛋白均為親水性蛋白，屬于非分泌蛋白，不具有信號(hào)肽,沒(méi)有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域;在它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高;MtNAC1和CaNAC1可能定位于葉綠體,NtNAC1和GmNAC1可能定位于線粒體,甘薯及其他6種作物的NAC1蛋白可能定位于細(xì)胞核;甘薯等NAC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與水稻NAC1蛋白具有一定的相似性;10種NAC1蛋白均含有1個(gè)NAM (No apical meristem)功能結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析顯示IbNAC1與CaNAC1的親緣關(guān)系最近。

甘薯;NAC1;生物信息學(xué);功能結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位；基因

NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特、功能多樣的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[1]。1996年Souer等首次從矮牽牛中分離得到第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子,研究表明該轉(zhuǎn)錄因子影響矮牽牛頂端分生組織的形成與分化[2];1997年Aida等報(bào)道矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2和CUC2編碼蛋白質(zhì)的N端均含有一個(gè)保守的NAC結(jié)構(gòu)域[3],取這3個(gè)基因名稱的首字母,后來(lái)將含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白統(tǒng)稱為NAC轉(zhuǎn)錄因子。近20年來(lái),科學(xué)家們相繼在水稻[4]、大豆[5]、楊樹(shù)[6]、葡萄[7]和煙草[8]等多種作物中克隆到NAC轉(zhuǎn)錄因子。氨基酸序列分析表明NAC家族轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),其編碼蛋白的N端含有高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域;而C端具有高度的多樣性,但脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸等單個(gè)氨基酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率高[9]。研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)直接參與或調(diào)控參與干旱、低溫或高鹽應(yīng)答基因的表達(dá),在植物抗干旱、低溫或高鹽等非生物逆境脅迫中起重要作用。如Hu等通過(guò)過(guò)表達(dá)OsNAC1基因增強(qiáng)了水稻的抗旱性和耐鹽性,并且提高水稻結(jié)實(shí)率34%以上[10];Tran等過(guò)表達(dá)AtNAC019、AtNAC055和AtNAC072/RD26不僅顯著提高了植株的抗旱性,還引起多個(gè)脅迫誘導(dǎo)基因的上調(diào)表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)它們可以與干旱誘導(dǎo)反應(yīng)基因ERD1 (Early responsive to dehydration )啟動(dòng)子中的CATGTG順式作用元件結(jié)合,從而調(diào)控ERD1以及下游基因的表達(dá)[11]。Tang等(2012)[12]在擬南芥中過(guò)表達(dá)TaNAC2,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱、抗鹽和抗冷害能力得到增強(qiáng);Mao等(2012)[13]在煙草中過(guò)量表達(dá)TaNAC2a,增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱的耐受性。除了參與非生物脅迫,近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物遭受病原菌等生物脅迫或抗病信號(hào)分子如SA、JA等處理?xiàng)l件下,其表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化[14-15],表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在作物抗病反應(yīng)中也起著至關(guān)重要的作用。

我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó),常年種植面積約為500萬(wàn)hm2。然而,部分甘薯主產(chǎn)區(qū)由于甘薯種植年限長(zhǎng)、引種不規(guī)范以及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)不完善,導(dǎo)致南病北移、南北病混發(fā),新發(fā)生病害如甘薯病毒病SPVD、甘薯褐斑病、甘薯白絹病等頻有報(bào)道,病蟲(chóng)害發(fā)生呈現(xiàn)逐步加重的趨勢(shì),嚴(yán)重制約了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[16]。由于甘薯在遺傳上的高度雜合性以及種內(nèi)和種間存在的廣泛雜交不親和性,采用常規(guī)育種方法選育抗病甘薯品種周期長(zhǎng)、效率低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,采用基因工程技術(shù)定向改良甘薯的性狀已成為現(xiàn)實(shí),這為甘薯抗病基因工程育種提供了一條新途徑,而獲得優(yōu)良抗病基因是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的前提和基礎(chǔ),因此對(duì)甘薯抗病相關(guān)基因的克隆、序列分析和功能研究顯得尤為重要。本文采用生物信息學(xué)分析方法,對(duì)甘薯等10種植物NAC1基因的氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位以及功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析,以期為甘薯NAC1基因(IbNAC1基因)的功能研究及其作用機(jī)制以及將IbNAC1應(yīng)用于甘薯抗病抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NAC1基因序列來(lái)源

從NCBI (National Center for Biotechnology Information, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)的核苷酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了甘薯等10種植物的NAC1基因的全長(zhǎng)CDS序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列:甘薯(Ipomoeabatatas),登錄號(hào)ACT55332.1;擬南芥(Arabidopsisthaliana),登錄號(hào)AF198054_1;蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula),登錄號(hào)AAF68626.1;茄子(Solanummelongena),登錄號(hào)AHB63601.1;大豆(Glycinemax),登錄號(hào)AAY46121.1;番茄(Solanumlycopersicum),登錄號(hào)AGJ52115.1;煙草(Nicotianatabacum),登錄號(hào)ACF19785.1;水稻(Oryzasativa),登錄號(hào)AIX03023.1;楊樹(shù)(Populustrichocarpa),登錄號(hào)XP_002310688.1;辣椒(Capsicumannuum),登錄號(hào)AAW48094.1。

1.2 研究方法

利用Blastp、ProtParam、NetPhos 3.1server、Protscale、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM、Signal 3.0、WoLF PROST等在線生物信息學(xué)程序進(jìn)行NAC1編碼的氨基酸組成、理化性質(zhì)、蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，蛋白疏水性或親水性預(yù)測(cè)和分析，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。采用生物信息學(xué)軟件DNAMAN進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)。采用Maga 6.0 軟件中的Neighbor-Joining法繪制蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物NAC1蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)分析

采用Physicochemical Property ProtParam對(duì)甘薯、擬南芥、蒺藜苜蓿、茄子、大豆、番茄、煙草、水稻、楊樹(shù)、辣椒等10種作物中NAC1蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)進(jìn)行分析,氨基酸殘基數(shù)目和相對(duì)分子量見(jiàn)表1。氨基酸含量分析表明，賴氨酸Lys、脯氨酸Pro和亮氨酸Leu為供分析的10種NAC1蛋白的主要氨基酸;蛋白穩(wěn)定性預(yù)測(cè)結(jié)果表明,甘薯、擬南芥、蒺藜苜蓿和楊樹(shù)等4種NAC1蛋白為非穩(wěn)定蛋白,其他6種NAC1蛋白為穩(wěn)定蛋白;等電點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,甘薯、擬南芥、蒺藜苜蓿和水稻等4種NAC1蛋白有酸性等電點(diǎn),其余6種NAC1蛋白有堿性等電點(diǎn)。以threshold大于0.5為標(biāo)準(zhǔn),得到各供試作物NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)量的預(yù)測(cè)結(jié)果,如表2所示,NAC1蛋白磷酸化位點(diǎn)主要為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,除煙草NAC1蛋白外,其他9種作物NAC1蛋白中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多,蘇氨酸和酪氨酸次之。

2.2 不同植物NAC1的疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析

ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：甘薯IbNAC1多肽鏈第13和14位谷氨酰胺(Q)最低分值為-3.500,親水性最強(qiáng);第52位異亮氨酸(I)最高分值為2.011,疏水性最強(qiáng)(圖1);從整體上來(lái)看,親水氨基酸數(shù)目均大于疏水氨基酸數(shù)目,由此推測(cè)IbNAC1為親水性蛋白。對(duì)甘薯之外的其他9種NAC1蛋白的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,也發(fā)現(xiàn)了各自的親水性最強(qiáng)的氨基酸和疏水性最強(qiáng)的氨基酸,但從整體分析都發(fā)現(xiàn)親水氨基酸數(shù)目大于疏水氨基酸數(shù)目,因此初步推測(cè)這10種NAC1蛋白均為親水性蛋白。

表1 不同作物NAC1蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)和分析結(jié)果

表2 甘薯等10種作物NAC1蛋白磷酸化作用位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

圖1 IbNAC1蛋白的親/疏水性預(yù)測(cè)

2.3 不同植物NAC1信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析

采用SignalP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),結(jié)果表明甘薯NAC1為非分泌蛋白,不含信號(hào)肽(圖2)。采用同樣的方法對(duì)其他9種作物中的NAC1蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),也得到了一致的結(jié)果,因此初步推測(cè)這10種NAC1蛋白均為非分泌蛋白，不含信號(hào)肽。

2.4 不同植物NAC1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

利用TMHMM對(duì)不同作物NAC1蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果在10種作物的NAC1蛋白中均未發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。

2.5 不同植物NAC1的二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)

采用在線軟件SOPMA對(duì)甘薯等作物NAC1氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果(表3)表明：甘薯NAC1由27.00% α-螺旋、17.00%延伸鏈、8.33% β-折疊和47.67%無(wú)規(guī)則卷曲組成；甘薯等10種NAC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高,為38.66%～53.76%;此外,α-螺旋和延伸鏈也是NAC1蛋白的主要二級(jí)元件,其中α-螺旋所占比例為11.83%～32.48%,延伸鏈所占比例為15.29%～26.52%;β-折疊所占比例最低，為5.41%～10.50%。

圖2 IbNAC1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖3 IbNAC1蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

采用WoLF PROST在線軟件預(yù)測(cè)NAC1蛋白的亞細(xì)胞定位,預(yù)測(cè)得分結(jié)果如表4所示,由該表可以看出：MtNAC1和CaNAC1定位于葉綠體的可能性較大;NtNAC1和GmNAC1定位于線粒體的可能性較大;甘薯及其他6種作物的NAC1蛋白定位于細(xì)胞核的可能性較大。

2.6 不同植物NAC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

以水稻NAC1蛋白3ulx.1.A為模板,進(jìn)行其他9種NAC1蛋白的同源建模,結(jié)果(圖4)表明：IbNAC1等其他9種NAC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)均與OsNAC1具有一定的相似性；但是α-螺旋和β-折疊的數(shù)目和狀態(tài)以及無(wú)規(guī)則卷曲的長(zhǎng)度等不盡相同，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)有所差異。由此推測(cè)它們雖然均屬同類轉(zhuǎn)錄因子,但各自所具有的功能可能不同。

表3 甘薯等10種作物NAC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及各元件含量預(yù)測(cè) %

2.7 不同植物NAC1蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析

采用NCBI Conserved domain search對(duì)NAC1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)：甘薯、辣椒、番茄等8種作物的NAC1蛋白的N-端均含有1個(gè)氨基酸殘基數(shù)目為120多的NAM (No apical meristem)結(jié)構(gòu)域(圖5);蒺藜苜蓿NAC1蛋白除含有1個(gè)氨基酸殘基數(shù)目為126的NAM超級(jí)家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域外,還含有1個(gè)氨基酸殘基數(shù)目為106的Marek-A超級(jí)家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域(圖6);煙草NAC1蛋白含有1個(gè)氨基酸殘基數(shù)目?jī)H為18的NAM超級(jí)家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域(圖7)。

2.8 不同植物NAC1蛋白氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)甘薯、水稻和擬南芥等4種NAC1蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,NAC1蛋白在N-端約150個(gè)氨基酸殘基具有高度的保守性,而C-端具有很強(qiáng)的多樣性,但從圖8可以發(fā)現(xiàn),這4種NAC1蛋白C-端仍然有苯丙氨酸(F)、天冬氨酸(D)、脯氨酸(P)等幾個(gè)較為保守的氨基酸。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果如圖9所示,10種不同植物的NAC1氨基酸序列聚成3簇,其中煙草和蒺藜苜蓿各自成一簇;甘薯、辣椒、番茄等其他8種作物的NAC1氨基酸序列聚成一簇。這表明IbNAC1與CaNAC1的親緣關(guān)系最近。

表4 甘薯等10種作物NAC1亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 IbNAC1(A)和OsNAC1(B)三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)

圖5 IbNAC1氨基酸序列功能域預(yù)測(cè)

圖6 MtNAC1氨基酸序列功能域預(yù)測(cè)

圖7 NtNAC1氨基酸序列功能域預(yù)測(cè)

圖9 甘薯等10種植物NAC1氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析

3 討論和結(jié)論

由于甘薯基因組的復(fù)雜性,目前關(guān)于其抗性基因的研究報(bào)道較少。王鈺等[17]克隆了甘薯抗病基因的同源序列(RGA),序列分析表明這些RGA屬于NBS-LRR類型,與L6、N、RGC1等抗病基因的同源性較高;陳觀水等[18]采用反轉(zhuǎn)錄PCR和RACE技術(shù),分離得到IbNPR1全長(zhǎng)cDNA并構(gòu)建植物表達(dá)載體進(jìn)行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化;柏潔等[19]采用反轉(zhuǎn)錄PCR分離到IbSGT1基因的全長(zhǎng)序列,定量PCR研究表明該基因在甘薯的根、莖、葉中均有表達(dá);Chen等[20]報(bào)道IbNAC1通過(guò)結(jié)合SWRE基序使得Sporamin基因上調(diào)表達(dá)從而抵御甘薯的機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食。已有的研究報(bào)道表明番茄等NAC1可參與病原菌或病毒侵染后的寄主反應(yīng),從而直接或間接調(diào)控植株的抗病性[21-22]。目前,我國(guó)在甘薯抗病鑒定方法的建立和抗病品種選育等方面取得了較好的成果,但是關(guān)于甘薯抗病基因及其分子調(diào)控機(jī)制方面的研究相對(duì)匱乏,IbNAC1是否參與甘薯抗病調(diào)控途徑值得我們進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)利用生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件對(duì)甘薯等10種植物NAC1基因的氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明：不同植物NAC1基因的氨基酸序列組成和理化性質(zhì)如穩(wěn)定性、等電點(diǎn)等有所差異,但都屬于親水性蛋白;供試10種作物NAC1蛋白磷酸化位點(diǎn)均主要為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸;均未發(fā)現(xiàn)有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽;在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高,其次是α-螺旋和延伸鏈,但各自所占比例有所差異;供試的10種NAC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,但由于α-螺旋和β-折疊的數(shù)目和狀態(tài)以及無(wú)規(guī)則卷曲的長(zhǎng)度等不盡相同，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)不同;甘薯NAC1蛋白可能定位于細(xì)胞核;甘薯等10種NAC1蛋白均含有NAM結(jié)構(gòu)域;進(jìn)化樹(shù)分析表明IbNAC1和CaNAC1的親緣關(guān)系最近。

對(duì)NAC1蛋白氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析有助于我們進(jìn)一步理解其對(duì)甘薯的脅迫調(diào)控作用及其分子機(jī)制,也可為該基因應(yīng)用于甘薯抗性分子育種奠定理論基礎(chǔ),對(duì)于甘薯基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際應(yīng)用都具有重要意義。

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BioinformaticsAnalysisofNAC1GeneinTenCropsIncludingSweetPotato

YANG Dong-jing, XU Zhen, ZHANG Cheng-ling, SUN Hou-jun, ZHAO Yong-qiang, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Science in Xu-Huai Region of Jiangsu / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweet Potato of Agricultural Ministry, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xuzhou 221131, China)

In this study, bioinformatics software was used to predict and analyze the amino acid sequence, physicochemical properties, phosphorylation sites, hydrophobicity (or hydrophilicity), secondary structure and tertiary structure, transmembrane domain, signal peptide, subcellular localization and conserved domains of NAC1 protein in sweet potato and other nine crops. The results showed that: the phosphorylation sites of tested ten kinds of NAC1 proteins were mainly serine, threonine and tyrosine; these NAC1 proteins were hydrophilic protein, and they belonged to non-secretory protein without both signal peptide and obvious transmembrane domain; random coil was the most important element in the secondary structure of these NAC1 proteins; MtNAC1 and CaNAC1 maybe were located in chloroplast, NtNAC1 and GmNAC1 might be located in mitochondria, and other six NAC1 proteins including IbNAC1 might be localized in cell nucleus; the tertiary structure of IbNAC1 protein and other NAC1 proteins was somewhat similar to that of OsNAC1 protein; all tested NAC1 proteins contained a NAM (No apical meristem) functional domain. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that IbNAC1 had the closest genetic relationship with CaNAC1.

Sweet potato; NAC1; Bioinformatics; Functional domain; Subcellular localization; Gene

2017-07-18

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-11-B-09);江蘇省政府留學(xué)獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目(JS-2014-120);教育部農(nóng)作物生

物災(zāi)害綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目。

楊冬靜(1983─),女,四川射洪人,助理研究員,碩士,主要從事植物病理學(xué)研究。*通訊作者:謝逸萍。

S531

A

1001-8581(2017)11-0007-06

(責(zé)任編輯:黃榮華)