綿羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其組織表達

高建鋒，盧曾奎，馬友記，*，李討討，趙興緒

(1.甘肅農業大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300； 3.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1661-1668

高建鋒，盧曾奎，馬友記，等. 綿羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其組織表達[J].浙江農業學報，2017，29(10)： 1661-1668.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.10

2017-04-01

甘肅省科技重大專項計劃(1602NKDH020)；甘肅農業大學校級課題(GSAU-ZL-2015-030)；國家肉羊產業技術體系項目(CARS-38)

高建鋒(1991—)，女，陜西榆林人，碩士研究生,從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail: 1518867937@qq.com

*通信作者，馬友記，E-mail: yjma@gsau.edu.cn

綿羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其組織表達

高建鋒1，2，盧曾奎1，2，馬友記1，2，*，李討討1，2，趙興緒3

(1.甘肅農業大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300； 3.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

為了探討綿羊(Ovisaires)MUSTN1基因特征及其在不同發育階段的背最長肌與股二頭肌組織中的表達規律，選取0、2、6、12和24月齡健康綿羊15只，每組3只，采取背最長肌和股二頭肌組織，應用分子生物學等方法，對MUSTN1基因CDS區進行克隆，對其進行生物信息學和組織表達分析。結果表明，MUSTN1基因CDS區全序列為248 bp，編碼82個氨基酸，其分子量為8.89 ku，等電點為9.93，GC含量大于AT含量，含有5個磷酸化位點、5個N-糖基化位點、1個O-糖基化位點、0個跨膜結構、疏水性蛋白，二級結構主要以無規卷曲為主；與山羊(Caprahircus)該基因核苷酸以及編碼氨基酸序列的同源性最高，分別為99.2%、100%，其次為牛(Bostaurus)，分別為97.2%、100%。MUSTN1基因在綿羊不同發育階段(0、2、6、12和24月齡)的背最長肌與股二頭肌中均有表達，在背最長肌中，24月齡MUSTN1表達量最高，極顯著高于其他月齡(P<0.01)，0月齡MUSTN1表達量最低，極顯著低于2、12月齡(P<0.01)，顯著低于6月齡(P<0.05)；而在6月齡綿羊股二頭肌中MUSTN1表達量最高且極顯著高于其他月齡(P<0.01)，24月齡表達量次之且極顯著高于12月齡(P<0.01)，顯著高于0月齡(P<0.05)。結論為綿羊MUSTN1基因的編碼區序列在物種間具有保守性，且在不同發育階段的背最長肌和股二頭肌組織中均表達，其表達量的高低可能與骨骼肌肉的生長快慢相關。

MUSTN1；綿羊；克隆；組織表達；序列分析

肌肉骨骼胚胎核蛋白1(musculoskeletal temporally activated novel gene，MUSTN1)基因于2004年在小鼠上初次被發現并驗證，共編碼82個氨基酸[1-2]。該基因啟動子區域有6個AP-1轉錄因子結合位點，試驗驗證發現，其中一個AP-1轉錄因子家族成員c-Fos、Fra-2和Jund負責該基因的轉錄活性，為骨骼肌肉特異性調控的關鍵因子[3]。因此，我們推測出MUSTN1基因可能是骨骼肌肉特異調控基因。

目前已有相關研究驗證了上述推測，如Liu等[4]研究發現MUSTN1基因在正常小鼠骨骼肌和肌腱內優先表達，且如果敲除該基因，就會導致小鼠成肌融合與分化受到抑制。Zheng等[5]研究發現MUSTN1基因能夠促進肉雞蛋雞骨骼肌生長。Koo等[6]研究發現，MUSTN1基因能夠致使美臀羊骨盆、四肢及腰部骨骼肌肉肥大，但也是導致美臀突變的上調基因之一。Liu等[7]應用RNA干擾技術研究了MUSTN1基因在肌原細胞中的功能，發現了沉默該基因后會使肌原細胞內肌纖維生長受阻，且表達水平也明顯降低。Kostek等[8-9]研究發現,MUSTN1基因不僅對肌肉損傷修復、軟骨細胞的增殖與分化具有一定作用，而且對骨骼肌肉的發育也起到了關鍵作用。由此可知，MUSTN1基因為肌肉骨骼特異調控基因。截至目前，鼠[10]、豬[11]、雞[12]、鴨[13]和斑馬魚[14]等物種MUSTN1基因克隆及其組織表達已有相關研究，而綿羊(Ovisaries)作為農牧區主要特種經濟動物，有關MUSTN1基因研究尚未見報道。為此，本試驗以小尾寒羊為研究對象，克隆MUSTN1基因的 CDS區全序列，并應用qRT-PCR技術對不同發育階段(0、2、6、12和24月齡)綿羊的背最長肌與股二頭肌中MUSTN1表達規律進行分析，為綿羊肌肉發育的調控網絡提供實驗手段和思路，也可為今后研究羊肉性狀的改良提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選取體質良好的小尾寒羊公羊15只，分別選取0、2、6、12和24月齡共5個時間點(每階段3只)，按月齡分組，以初生24 h內記為0月齡，同一組月齡與體重相似，均源自甘肅省景泰縣三羊養殖公司。試驗羊經頸靜脈放血處死后，迅速取其背最長肌、股二頭肌等組織樣品，標記后迅速投于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 綿羊組織總的RNA提取及cDNA的合成

取綿羊背最長肌和股二頭肌組織樣品迅速轉移到滅菌的勻漿器中并將其磨碎，按TransZol UPRNA提取試劑盒(北京全式金生物公司)操作說明提取不同發育階段肌肉(背最長肌、股二頭肌)組織總RNA，用超微量分光光度計(Implen公司，德國)測定濃度及光密度值(optical density，OD)，依據測定結果，篩選出合格的RNA樣品，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，選擇完整性好的RNA將其濃度調整為500 ng·μL-1。按 Rever-tAid First Strand cDNA Synthesis Kit (北京全式金生物公司)操作說明中的兩步法進行cDNA第一鏈的合成，編號后產物置于-20 ℃保存。

1.3 綿羊MUSTN1基因的克隆

將GenBank數據庫中綿羊(Ovisaires，XM_004018390.3)和牛(Bostaurus，NM_001040589.2)MUSTN1基因序列進行比對分析，根據一致性最高的保守序列采用Premier 6.0 和Oligo6.0軟件設計引物A1(表1)，以背最長肌組織cDNA為模板，PCR擴增綿羊MUSTN1 CDS區全序列。PCR反應體系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, cDNA 1 μL(500 ng·μL-1),上、下游引物各0.8 μL, ddH2O 10 μL。反應程序：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，64℃ 30 s，72℃ 90 s，40個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，使用紫外凝膠成像儀(Bio-Rad)觀察結果。將目的基因片段使用膠回收試劑盒(Omega，USA)回收，與PMD19T(TaKaRa，Japan)載體連接后轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，經藍白斑篩選挑取陽性菌落進行菌落PCR擴增，經初步鑒定為陽性克隆的菌液，取1 mL新鮮菌液送上海生工進行序列測定。

1.4 MUSTN1基因的生物信息學分析

利用NCBI的工具ORF Finder(http://www.ncb.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)對獲得的CDS序列翻譯成氨基酸序列，采用Prot Param 軟件預測蛋白基本理化性質；采用Bio edit軟件分析基因

全編碼區序列中堿基組成并對該蛋白親疏水性進行分析；采用Signal p4.0軟件預測蛋白潛在信號肽剪切位點；采用TMPRED和TMHMM2.0對蛋白跨膜區與螺旋結構進行預測；采用NetPhos2.0、NETOGLYc3.1 和NetNGlyc1.0軟件對蛋白潛在磷酸化位點、O-糖基和N-糖基化位點進行分析；應用Protfun軟件預測蛋白功能；采用Hopfield軟件分析蛋白二級結構，Swiss-modl軟件結合PDB數據庫綜合獲得蛋白三級結構；采用 DNAMAN軟件分析綿羊MUSTN1基因CDS區序列，氨基酸序列與其他物種的相似性；最后使用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

1.5 實時熒光定量 PCR

獲得綿羊MUSTN1基因完整的CDS區序列后，利用該序列設計實時熒光定量PCR(qPCR)引物，選用β-actin(NM_001009784.2)作為內參基因。采用 Primer Premier 6.0 軟件設計熒光定量引物A2和A3(表1)。20 μL反應體系如下：2×TranStart TipGreen qPCR SuperMix 10 μL、A2和A3上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL。擴增程序采用三步法：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45個循環。每個樣品重復3次，反應結束后觀察擴增曲線和熔解曲線。

1.6 統計分析

根據熒光定量所得到的Ct值，采用2-ΔΔCt方法進行結果處理，運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗，數據均用平均值±標準誤(χ±SE)表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1MUSTN1基因的克隆與序列分析

表1引物序列信息

Table1The information of primer sequence

基因Gene引物序列Primersequence(5′?3′)產物長度Productlength/bp退火溫度Annealingtemperature/℃MUSTN1A1F：GGGACAGGCAAGCAGACT48164R：CCAAGGTGGCAGGTGAGAA2F：CCACAGCACCCACCATGTCC16059R：TGCTCACATTCCCGCATGACCβ?actinA3F：CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG18059R：GCCAGGGCAGTGATCTCTTT

以A1為引物進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現單一的目標條帶，沒有拖尾現象，條帶大小在481 bp左右(圖1)；挑選陽性單克隆菌液進行測序，結果發現編碼區無堿基位點突變，通過NCBI在線 PRF Finder軟件分析發現，該基因CDS編碼區為349～597，共248 bp，其中包含1個起始密碼子ATG，共編碼82個氨基酸。

2.2 綿羊MUSTN1基因的生物信息學分析

通過在線軟件ProtParam分析得到MUSTN1基因分子量為8.893 ku，等電點(pI)為9.93；用Bioedit軟件分析MUSTN1基因CDS區全序列(248 bp)，分析發現其4種堿基數分別是60(A)、71(C)、81(G)、37(T)，各占24.10%、28.51%、32.53%、14.86%；采用SignalP4.0軟件發現該蛋白C值、S值和Y值均值小于0.5，說明不存在信號肽結構(圖2)；采用TMPRED和TMHMM 2.0軟件分析，結果顯示該蛋白不存在跨膜區域(圖3，圖4)；采用 NetPhos2.0軟件分析該蛋白潛在磷酸化位點，結果表明存在3個蘇氨酸(Ser)、2個絲氨酸(Thr)和 0個酪氨酸(Tyr)(圖5)；經 NETOGlyc3.1和NetNGlyc1.0 軟件分析預測，發現該蛋白潛在O-糖基化位點有3個Ser糖基化位點和2個Thr (圖6)，N-糖基化位點有1個(圖7)。釆用Bio edit軟件對該蛋白的親疏水性進行分析，表明該蛋白氨基酸殘基基本上為疏水(圖8)；采用Protfun軟件預測了該蛋白的功能，表明該蛋白具有復制和轉錄、脂肪酸代謝、調節功能、翻譯等功能的可能性分別為1.213、1.265、1.316、4.555，說明該蛋白主要在翻譯中發揮重要作用；通過 Hopfield軟件分析可知，該蛋白二級結構(圖9)中α螺旋(Alpha helix)(Hh)為25.61%，β折疊(extended strand)(Ee)為3.66%，無規卷曲(random coil)(Cc)為70.73%，可預測該蛋白二級結主要以無規卷曲為主；利用Swiss-model軟件和PDB數據庫綜合預測MUSTN1蛋白三級結構，獲得了最佳模板(圖10)。

M， DNA Marker DL2000；1～3， 引物MUSTN1 A1的PCR產物(481 bp)M， DNA Marker DL2000；1-3， PCR products of MUSTN1 (481 bp)圖1 綿羊MUSTN1基因PCR產物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis results of MUSTN1 gene PCR product

圖2 MUSTN1蛋白信號肽分析Fig.2 MUSTN1 protein signal peptide analyses

圖3 MUSTN1蛋白跨膜區結果Fig.3 Prediction of transmembrane regions of MUSTN1 protein

圖4 MUSTN1蛋白跨膜螺旋結構預測圖Fig.4 Prediction graphic of MUSTN1 protein transmembrane helices

圖5 MUSTN1蛋白磷酸化位點分析Fig.5 MUSTN1 protein phosphorylation site analyses

圖6 MUSTN1蛋白糖基化位點分析Fig.6 MUSTN1 protein O-glycosylation site analyses

圖7 MUSTN1蛋白糖基化位點分析Fig.7 MUSTN1 protein N-glycosylation site analyses

水平線為氨基酸的殘基數，垂直線代表相對的親水區，零點以上為疏水區，零點以下為親水The horizontal line represents the number of residues of amino acids， and the vertical lines represent the relative hydrophilic regions. The points above the line indicated hydrophobic region， and the point below zero horizontal line was corrsesponded to hydrophobic region圖8 MUSTN1蛋白的疏水性Fig.8 The hydrophobicty of MUSTN1 protein

2.3綿羊MUSTN1基因的同源性比較

采用DNAMAN軟件將所得綿羊MUSTN1基因核苷酸及編碼氨基酸序列分別與表2其他物種進行同源性比較，結果顯示，與表2中其他物種相似度分別在70.00%～99.20%，82.93%～100%。同時應用MEGA 6.0軟件對表2中物種的氨基酸序列構建系統進化樹(圖 11)，發現其與山羊親緣關系最近，其次為牛。

c， 無規則卷曲;h， 螺旋; e， 延伸片段c, represents random coil; h, represents Alpha helix; e, represents extended strand圖9 綿羊MUSTN1 蛋白二級結構分析Fig.9 The analysis of secondary structure of sheep MUSTN1 protein

圖10 MUSTN1蛋白三級結構模型Fig.10 Tertiary structure of MUSTN1 protein

2.4不同月齡下綿羊肌肉中MUSTN1 mRNA表達

應用熒光定量PCR技術對不同月齡(0、2、6、12、24月齡)綿羊背最長肌與股二頭肌中MUSTN1基因表達量進行檢測(圖12)。結果顯示，MUSTN1 mRNA在不同月齡的背最長肌與股二頭肌中均表達，在背最長肌中，MUSTN1基因在24月齡中表達量達到最高，與其他4個月齡相比差異性均達到極顯著水平(P<0.01)，2、12月齡的表達量極顯著高于0月齡(P<0.01)，且2與12月齡之間差異性不顯著(P>0.05)，6月齡與0月齡之間差異性顯著(P<0.05)，在股二頭肌中，MUSTN1基因表達量在6月齡最高，且表達量極顯著高于其他4個月齡(P<0.01)，24月齡極顯著高于12月齡(P<0.01)，顯著高于0月齡(P<0.05)，且0月齡與12月齡之間差異不顯著(P>0.05)，2與0、12、24月齡表達基本處于相對平穩水平(P>0.05)。

表2綿羊MUSTN1核苷酸與氨基酸序列與其他物種的相似性比較

Table2Comparison of the similarity ofMUSTN1 nucleotide and amino acid sequence of sheep and other species

種名SpeciesGenBank登錄號GenBankNo．核苷酸相似度/%Nucleotidesimilarity氨基酸相似度/%Aminoacidsimilarity山羊(Caprahircus)XM＿018067100199210000牛(Bostaurus)NM＿001040589297210000人(Homosapiens)NM＿20585339029512小鼠(Musmusculus)NM＿18139038448902雞(Gallusgallus)NM＿21358027008293

圖11 六個物種MUSTN1蛋白系統進化樹Fig.11 Phylogenetic tree constructed for MUSTN1 protein of 6 species

同一組織不同月齡的不同大寫字母分別代表差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01)， different lowercase letters represent significant difference (P<0.05) at different months in the same tissue圖12 綿羊MUSTN1在背最長肌、股二頭肌不同發育階段中的mRNA水平Fig.12 Relative expression level of sheep MUSTN1 gene in longissimus dorsi and biceps femoris at different months

3 討論

應用分子克隆技術獲得綿羊MUSTN1基因完整CDS區序列，全長248 bp，編碼82個氨基酸，而 Han等[11]在研究豬時發現，該基因編碼區全長為237 bp，編碼78個氨基酸；徐鐵山[12]、李娟等[13]也在研究禽類(鴨、雞)中發現，該基因CDS區全長222 bp，編碼78個氨基酸，這種差別揭示了不同物種間遺傳距離的遠近。同時李娟等[13]還指出雞MUSTN1蛋白與小鼠、牛、人和綿羊的同源氨基酸相似度高達75%以上，而本研究中綿羊MUSTN1蛋白同樣與山羊、牛、小鼠和人的同源氨基酸相似度也高達80%以上，由此表明MUSTN1在物種間具有保守性。

盡管目前有關MUSTN1基因發育過程中的表達研究較少，其表達模式也不一致，如 Xu等[14]研究發現，北京鴨MUSTN1基因在2、4、6周齡胸肌中表達量逐漸增加，在6周齡達到峰值，而在8周齡又有所下降；而在腿肌組織中，MUSTN1基因表達量從出生后1周到3周升高，而且至9周均持續降低。Li等[15]研究發現，雞MUSTN1基因在不同日齡胸肌與腿肌組織中，其表達趨勢為下降—上升—下降，且0日齡表達量最高，同時還比較了相同日齡的胸肌與腿肌組織，胸肌1～28日齡表達量下降，腿肌1～28日齡為上升，說明MUSTN1基因在不同發育期肌肉組織中的差異性表達可能與動物肌肉生長速度快慢和組織特異性相關，而動物肌肉生長速度的快慢又受營養[17]、遺傳[18]、性別[19]以及子宮內環境[20]影響。因此，結合本研究分析發現，MUSTN1基因在綿羊背最長肌與股二頭肌中，0月齡表達量較低，可能由于在胎兒的肌發生間，由于營養供應不足、營養分配不均勻和子宮內容積限制而使肌發育受阻；0～2月齡表達量持續上升，可能是由于綿羊斷奶前(60 d左右)營養物質的攝入較多，可促進肌肉的發育；在 2～6月齡，背最長肌MUSTN1表達量處于下降趨勢，可能由于斷奶后，初次攝食不適應而導致消化不良、腹瀉造成營養物質供應不足，在這樣的情況下，由于骨骼肌在營養分配上不具有優先性，進而影響肌肉的發育；6～24月齡背最長肌MUSTN1表達趨勢又有所上升，表明此時營養物質充足且營養分配均勻，促進了骨骼肌肉的發育。而在股二頭肌中，MUSTN1表達量在2～6月齡處于上升趨勢，6～12月齡處于下降趨勢，與背最長肌中該基因的表達相反，其原因可能是由于組織與發育特異性表達所致。

[1] LOMBARDO F， KOMATSU D， HADJIARGYROU M. Molecular cloning and characterization of Mustang， a novel nuclear protein expressed during skeletal development and regeneration[J].FASEBJournal:OfficialPublicationoftheFederationofAmericanSocietiesforExperimentalBiology， 2004， 18(1):52-61.

[2] HADJIARGYROU M， LOMBARDO F， ZHAO S， et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair[J].JournalofBiologicalChemistry， 2002， 277(33):30177-30182.

[3] LIU C， HADJIARGYROU M. Identification and characterization of the Mustang promoter: regulation by AP-1 during myogenic differentiation[J].Bone， 2006， 39(4):815-24.

[4] LIU C， KRONENBERG M， JIANG X， et al. Characterization of MUSTN1 PRO-GFPtpz transgenic mice[C]// IEEE， Northeast Bioengineering Conference.IEEE，2007:13-14.

[5] ZHENG Y， WANG L S， XIA L， et al. NDRG1 is down-regulated in the early apoptotic event induced by camptothecin analogs: the potential role in proteolytic activation of PKC delta and apoptosis[J].Proteomics， 2009， 9(8):2064-2075.

[6] KOO B S， KIM S K， JOO W D， et al. Identification of a gene network contributing to hypertrophy in callipyge skeletal muscle[J].PhysiologicalGenomics， 2007， 28(3):253-272.

[7] LIU C， GERSCH R P， HAWKE T J， et al. Silencing of Mustn1 inhibits myogenic fusion and differentiation[J].AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology， 2010，298(5):C1100.

[8] KOSTEK M C， CHEN Y W， CUTHBERTSON D J， et al. Gene expression responses over 24 h to lengthening and shortening contractions in human muscle: major changes in CSRP3， MUSTN1， SIX1， and FBXO32[J].PhysiologicalGenomics， 2007， 31(1):42-52.

[9] GERSCH R P， KIRMIZITAS A， SOBKOW L， et al. MUSTN1 is essential for craniofacial chondrogenesis during Xenopus development[J].GeneExpressionPatterns， 2012， 12(3/4):145.

[10] KRAUSE M P， MORADI J， COLEMAN S K， et al. A novel GFP reporter mouse reveals Mustn1 expression in adult regenerating skeletal muscle， activated satellite cells and differentiating myoblasts[J].ActaPhysiologica， 2013， 208(2):180-190.

[11] HAN X L， XU X W， LIU B. Molecular characteristics of the porcine MUSTN1 gene and its significant association with economic traits[J].JournalofAnimal&VeterinaryAdvances， 2010， 9(18):2351-2356.

[12] 李娟. 雞生長發育和肌纖維生長的影響因素與相關基因表達研究[D].雅安：四川農業大學， 2013.

LI J. Study on the influence factors about growth and muscle fiber related gene expression of chickens[D]. Ya’an: Sichuan Agricultural University， 2013.(in Chinese with English abstract)

[13] 徐鐵山. 北京鴨胸肌發育差異表達基因分離鑒定及其與胸肌發育的關系研究[D].楊凌：西北農林科技大學， 2014.

XU T S. The isolation and identification of differentially expressed genes in Pekin duck breast muscle the hr association with muscle[D]. Yangling: Northwest A&F University， 2014.(in Chinese with English abstract)

[14] CAMARATA T， VASILYEV A， HADJIARGYROU M. Cloning of zebrafish MUSTN1 orthologs and their expression during early development[J].Gene， 2016， 593(1):235-241.

[15] XU T S， GU L H， SUN Y， et al. Characterization of MUSTN1 gene and its relationship with skeletal muscle development at postnatal stages in Pekin ducks[J].Genetics&MolecularResearch， 2015， 14(2):4448-4460.

[16] LI J， CHEN Y， WANG Y G， et al. MUSTN1 mRNA abundance and protein localization is greatest in muscle tissues of Chinese meat-quality chickens[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2013，14(3):5545-5559.

[17] DU M， ZHU M J， MEANS W J， et al. Nutrient restriction differentially modulates the mammalian target of rapamycin signaling and the ubiquitin-proteasome system in skeletal muscle of cows and their fetuses[J].JournalofAnimalScience， 2005， 83(1):117-123.

[18] HICKFORD J G， FORREST R H， ZHOU H. Association between a g.+6723G-A SNP in the myostatin gene (MSTN) and carcass traits in New Zealand Texel sheep[J].JournalofAnimalScience， 2009， 87(6):1853.

[19] ABE T， KEARNS C F， FUKUNAGA T. Sex differences in whole body skeletal muscle mass measured by magnetic resonance imaging and its distribution in young Japanese adults[J].BritishJournalofSportsMedicine， 2003， 37(5):436-440.

[20] WU G， BAZER F W， WALLACE J M， et al. Board-invited review: intrauterine growth retardation: implications for the animal sciences[J].JournalofAnimalScience， 2006， 84(9):2316-2337.

Cloning，sequenceanalysisandtissueexpressionofMUSTN1geneinsheep(Ovisaires)

GAO Jianfeng1，2，LU Zengkui1，2，MA Youji1，2，*，LI Taotao1，2，ZHAO Xingxu3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.GansuEngineeringLaboratoryofSheepBreedingBiotechnology，Minqin733300，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

In order to studyMUSTN1 gene characteristics of sheep (Ovisaires) and its expression at different developmental stages inlongissimusdorsiandbicepsfemoris， fifteen sheep longissimus dorsi and biceps femoris tissues were collected at 0， 2， 6， 12 and 24 month old stages (three replicates for each). With application of molecular biology and other methods， the bioinformatics and tissue expression of the coding region ofMUSTN1 gene were cloned and analyzed. The results showed that the CDS region of theMUSTN1 gene was 248 bp， encoded with 82 amino acid， molecular weight of 8.89 ku， its theoretical isoelectric point is 9.93， the GC content is greater than AT content， 5 phosphorylation sites， 5 N-glycosylation site， 1 O-glycosylation site， 0 transmembrane structure， hydrophobic protein and the secondary structure of MUSTN1 protein is dominated by random coil; the highest homology was 99.2% and 100% in the nucleotide and the amino acid sequence of goat (Caprahircus)， followed byBostaurus(97.2% and 100%， respectively).MUSTN1 gene was expressed in thelongissimusdorsiandbicepsfemorisat different developmental stages (0， 2， 6， 12 and 24 month old). The expression ofMUSTN1 in thelongissimusdorsiwas the highest at 24 month-old， which was significantly higher than those at other month old (P<0.01). The expression ofMUSTN1 was the lowest at 0 month and significantly lower than that in 2 and 12 month old (P<0.01)， significantly lower than that in 6 month old (P<0.05). The expression ofMUSTN1 in 6 month old sheep biceps femoris was the highest and significantly higher than other month old (P<0.01). The expression level of 24 month old was significantly higher than that in 12 month old (P<0.01) and 0 month old (P<0.05). The conclusion was that the coding sequence of theMUSTN1 gene of sheep was conserved among species and expressed in the sheep of the dorsal long muscle and biceps femoris muscle at different development stages. The expression level ofMUSTN1 gene may be related to the growth of skeletal muscle.

MUSTN1; sheep (Ovisaries); cloning; tissue expression; sequence analysis

S826

A

1004-1524(2017)10-1661-08

（責任編輯張 韻)