煙草NtCIPK2基因的克隆及表達分析

卓 維，陳 倩，魯黎明，李立芹

(四川農業大學 農學院，四川 成都 611130)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1611-1619

卓維，陳倩，魯黎明，等．煙草NtCIPK2基因的克隆及表達分析[J]．浙江農業學報，2017，29( 10) : 1597 - 1604．

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.01

2017-04-14

植物生理學與生物化學國家重點實驗室開放課題(SKLPPBKF 1505, SKLPPBKF 1506)

卓維(1994—)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究。E-mail: 992167898@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@163.com

煙草NtCIPK2基因的克隆及表達分析

卓 維，陳 倩，魯黎明，李立芹*

(四川農業大學 農學院，四川 成都 611130)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一類具有生物活性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過與類鈣調神經素 B 亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)相互作用從而調節植物在適應或抵制非生物逆境脅迫中的生理活動?；谕葱蛄锌寺煵軰326中NtCIPK2基因cDNA全長，采用qRT-PCR分析NtCIPK2的組織及逆境脅迫下特異性表達。結果表明，該基因全長1 341 bp，編碼446個氨基酸殘基，預測分子量為50.3 ku，等電點為8.90。同源性分析結果顯示，該蛋白與絨毛狀煙草(Nicotianatomentosiformis)CIPK2有95%的同源性，故命名為NtCIPK2。生物信息學分析表明，該蛋白是一個親水蛋白，其N端含有活化環結構域S_TKc，C端含有調節結構域CIPK-C，可能定位在質膜。組織表達分析發現，該基因在煙草根、莖、葉、花中均有表達，其中莖中表達量最高。逆境脅迫試驗表明，該基因受低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA誘導，參與煙草非生物逆境脅迫的響應。

煙草；NtCIPK2；克??；生物信息學；基因表達

煙草是我國重要的模式生物和經濟作物，無論是在基礎研究領域，還是在農業經濟方面，都發揮著重要的作用。低鉀、干旱、鹽堿、冷害等非生物脅迫嚴重影響煙葉的產量及品質，尤其是低鉀脅迫影響為甚[1]?，F今在我國鉀素資源相對貧乏，煙葉中鉀含量也普遍偏低。所以如何提高煙葉中鉀含量及煙草的抗逆性成為當前重要的研究方向。

Ca2+是植物體中普遍存在的第二信使，在植物生長發育以及脅迫調節中發揮重要作用。研究表明，植物在受到逆境脅迫時，首先引發細胞內鈣離子濃度的變化[2]，改變的Ca2+濃度會被相應的Ca2+感受器感知，并進一步將信號傳遞至下游。類鈣調神經素B亞基蛋白CBL是植物中一類特殊的鈣感受器，能識別不同的鈣信號。CIPK是一類植物中特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]。CBL與CIPK相互作用后能解除CIPK自抑制，形成CBL-CIPK復合體，活化狀態的復合體能磷酸化修飾下游靶蛋白，從而解碼鈣信號，并進一步將信號轉化為細胞的生理反應[4-5]。

CIPK蛋白激酶家族中每個成員的調節結構域中均含有一個保守的24個氨基酸組成的FISL基序(又稱NAF結構域)，該基序是一個自抑制結構域并介導與CBL的作用[6]。研究發現，水稻中有27個，擬南芥中有26個，楊樹中有33個CIPK家族成員[7-8]。CIPK在植物響應高鹽、低溫、高溫和低鉀信號轉導過程中發揮重要作用[9]。野大麥HbCIPK2在干旱、高鹽和ABA脅迫下表達增強[10]。玉米ZmCIPK2在高鹽、PEG、低溫和熱處理下被大量誘導上調[11]。煙草中NtCIPK23受到干旱、鹽脅迫誘導[12]。

本研究從普通煙草K326中克隆到一個NtCIPK2基因，利用生物信息學分析NtCIPK2蛋白的理化性質、疏水性，并進行蛋白結構預測、信號肽預測以及同源性分析，同時運用qRT-PCR研究其在煙草根、莖、葉、花組織中的表達水平，以及低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA非生物逆境脅迫下該基因的表達水平，旨在為今后NtCIPK2的功能研究奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

本試驗使用的植物材料為普通煙草K326。

大腸埃希菌感受態DH5α購自Vazyme Biotech公司；目的基因的克隆及回收使用的Trizol試劑、載體PMD19-T、高保真Pfu酶，cDNA合成試劑盒，SYBR Green Master mix、限制性內切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa，DNA凝膠純化回收試劑盒購自天根公司；引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理

首先挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子進行表面消毒，先用75%的乙醇消毒30 s，然后10%的次氯酸鈉溶液消毒2次，每次10 min，最后用無菌水反復清洗5～6次后播種于MS培養基上，置于16 h光/8 h暗，25 ℃的光照培養箱中培養15 d后，挑取長勢一致的幼苗進行低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA處理，每個處理設有3盤重復，處理相應時間(0、3、6、12、24 h)后進行整株取樣。低鉀培養基是去掉MS培養基中的KNO3，并且用NH4H2PO4代替KH2PO4，濃度為10 μmol·L-1K+，其余成分相同。高鹽、干旱、H2O2和ABA處理培養基是在MS培養基中分別加入NaCl(200 mmol·L-1)、PEG-6000(5%)、H2O2(10 mmol·L-1)和ABA(1 μmol·L-1)。

1.2.2 煙草NtCIPK2 基因的克隆

參考GenBank收錄的絨毛狀煙草CIPK2序列(XM_018779044.1)，采用同源克隆的方法，用DNAMAN軟件設計全長引物NtCIPK2-F和NtCIPK2-R(表1)。擴增反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35個循環。目的片段純化后與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態，隨后在含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體平板上進行篩選，菌落PCR檢測篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 煙草NtCIPK2基因生物信息學分析

利用ExPASyProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam)分析 NtCIPK2編碼蛋白的理化性質；用在線軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的疏水性；運用IBCP的在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)預測蛋白的二級結構；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線預測NtCIPK2的三級結構；利用 Signal-P 在線預測蛋白質信號肽；利用 CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)軟件在線分析NtCIPK2編碼蛋白氨基酸的結構域；采用在線工具PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預測NtCIPK2的亞細胞定位；運用MEGA5、Bio Edit及Clustalx-2.0.9軟件以鄰近法構建系統進化樹。

1.2.4 煙草 NtCIPK2 基因的表達分析

根據基因序列，采用Primer Premier 5.0設計qRT-PCR引物NtCIPK2-qF和NtCIPK2-qR，采用煙草的18SrRNA為內參進行表達差異研究。qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s和60 ℃延伸45 s，進行39個循環。所有的樣品都設置3個重復，反應結束后，基因相對表達水平用2-ΔΔCt方法進行計算(表1)。

2 結果與分析

2.1 NtCIPK2基因克隆

提取煙草葉片總RNA，以其反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，電泳結果顯示在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體進行連接，

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名稱Primername引物序列PrimersequencesNtCIPK2?FNtCIPK2?RNtCIPK2?qFNtCIPK2?qR18sF18SR5′?ATGGAGGAGAAGAAAGGAAA?3′5′?CTAACTATTAATTGGCTGCT?3′5′?TGCCAATGCTAATGTCGA?3′5′?TTCCTCCTTCTGATCCTTTC?3′5′?CCTACGCTCTGTATACATTAGC?3′5′?GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC?3′

1， NtCIPK2基因；M， Marker 1， NtCIPK2 PCR product; M， Marker圖1 NtCIPK2基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of NtCIPK2 PCR product

轉化大腸埃希菌DH5α。運用菌落PCR方法鑒定陽性克隆，隨機挑選3個陽性克隆送至測序公司進行測序。測序結果顯示，目的片段大小為1 341 bp，通過NCBI上Blast比對發現該序列與普通煙草CIPK2(XM_016635422.1)序列完全一致。

2.2 NtCIPK2基因的生物信息學分析

2.2.1 NtCIPK2編碼蛋白的理化性質及疏水性分析

蛋白質的理化性質包括氨基酸組成、分子質量、等電點和不穩定系數等。分析顯示，NtCIPK2基因共編碼446個氨基酸，其中亮氨酸(11.2%)，賴氨酸(10.1%)，谷氨酸(8.7%)，絲氨酸(7.0%)含量偏高，色氨酸(1.1%)含量最低。該蛋白預測的分子量為50.3 ku，理論等電點pI為8.90，不穩定系數(instability index)為32.66，說明該蛋白可能是一個穩定的堿性蛋白。同時，其親水性平均指數為-0.265，用在線軟件ProtScale進行疏水性分析(圖2)，結果預測該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3.2 NtCIPK2蛋白的二級、三級結構預測

利用IBCP的在線工具SOPMA對NtCIPK2蛋白的二級結構進行預測發現，該蛋白中35.43%的氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，30.72%的氨基酸參與無規則卷曲(random coil)，21.52%的氨基酸參與延伸鏈(extended strand)，12.33%的氨基酸參與β-轉角(Beta turn)，由此可見，該蛋白二級結構的最大元件為α-螺旋(圖3)。運用 SWISS-MODEL對NtCIPK2的三級結構進行了預測，RasTop軟件進行顯示(圖4)，并將結果與二級結構預測進行比照，結果較為統一。

圖2 NtCIPK2蛋白疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of NtCIPK2 protein

圖3 NtCIPK2蛋白的二級結構預測Fig.3 Predicted secondary structure of NtCIPK2 protein

圖4 NtCIPK2蛋白的三維結構預測結果Fig.4 The predicted advanced structure of NtCIPK2 protein

2.3.3 NtCIPK2蛋白信號肽預測

蛋白質信號肽的預測有助于區分其功能結構域和細胞定位。利用Signal-P4.1軟件分析NtCIPK2蛋白信號肽，根據信號肽序列的特征，采用神經網絡方法或隱馬氏模型方法預測信號肽位置及切割位點。其中用Y-score maximum來判斷信號肽切割位點，用mean S-score來判斷是否是分泌蛋白(圖5)，預測結果顯示，Score為0.104，小于0.5，則預測該蛋白不是分泌蛋白，不存在信號肽。

2.3.4 NtCIPK2蛋白的結構域及亞細胞定位分析

利用NCBI數據庫的CDD軟件對NtCIPK2編碼蛋白的結構域進行分析(圖6)，結果表明，該蛋白在N端含有保守的活化環結構域(S_TKc)，此結構域從第13位到267位氨基酸結束，該區域磷酸化可以激活CIPK的活性。另外，其C端含有一個與CBL相互作用的調節結構域(CIPK-C)，此結構域從318位到431位氨基酸結束，是確定CIPK家族蛋白的重要標志。

利用PSORT在線預測NtCIPK2的亞細胞定位，結果顯示，該蛋白在質膜上占0.700，在微體上占0.300，在內質網中占0.200，在線粒體內膜中占0.100，預測NtCIPK2可能定位在質膜上。

2.3.5 NtCIPK2同源性分析

把NtCIPK2編碼的氨基酸序列在 NCBI 數據庫中進行 Blast比對，按照相似性程度高低選擇19個基因編碼的氨基酸序列(包括 NtCIPK2)構建系統進化樹(圖7)，結果表明，NtCIPK2與絨毛狀煙草CIPK2(XP_009630199.1)、馬鈴薯CIPK18(XP_006365327.1)、番茄CIPK(XP_015076663.1)等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為95%、94%、89%，與油棕CIPK18(XP_010937988.1)和菠蘿CIPK2(OAY79966.1)的同源性最低，均為69%。

圖5 NtCIPK2的信號肽預測Fig.5 Signal peptide prediction of NtCIPK2

圖6 NtCIPK2的結構域分析Fig.6 Structure domain analysis of NtCIPK2

圖7 NtCIPK2進化樹分析Fig.7 The phylogenetic tree analysis of NtCIPK2

2.4 NtCIPK2的組織表達分析

以生長60 d K326無菌苗的根、莖、葉以及成熟苗盛花期的花為材料提取RNA，反轉錄得到的cDNA為模板進行qRT-PCR反應，分析NtCIPK2在各個組織的表達量，NtCIPK2在根、莖、葉、花中均有表達，其中在莖中的表達量最高，其次是在根中的表達，在花中的表達量最低。在莖中表達量是在根中的2.6倍，是葉中的10.7倍，是花中的24.1倍。說明NtCIPK2主要在煙草K326植株的莖中表達(圖8)。

2.5五種非生物逆境脅迫下NtCIPK2的表達分析

采用qRT-PCR對NtCIPK2在低鉀(10 μmol·L-1K+)、5% PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA處理后的表達量進行分析。低鉀處理后，NtCIPK2表達量在12 h達到最大為對照(0 h)的5.11倍。5% PEG-6000和H2O2處理后，該基因都在3 h達到最大，分別為對照(0 h)的1.63倍和1.87倍(圖9)。

高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理后，NtCIPK2表達量在6 h達到最大，為對照(0 h)的5.95倍；在1 μmol·L-1ABA處理下，該基因表達量先下降后上升，12 h最低僅為對照(0 h)的39.1%，24 h最大為對照(0 h)的4.99倍(圖9)。

3 討論

CIPK基因家族廣泛分布于高等植物根、莖、葉等組織器官中。本試驗從普通煙草K326中克隆到一個CIPK家族成員NtCIPK2基因的cDNA序列，通過對其編碼的蛋白CIPK2結構域分析，其N端激酶催化域含有一個典型激活環S_TKc，C-端含有一個調節結構域CIPK-C。調節結構域中包含的高度保守NAF結構域是CIPKs家族的典型特征[13]。CIPK分子的活化依賴于NAF基序的自我抑制與特定CBL的相互作用，兩者共同解讀植物脅迫下細胞的鈣信號變化[14]。氨基酸序列比對分析發現，NtCIPK2與絨毛狀煙草CPK2、馬鈴薯CIPK18等具有很高同源性。亞細胞定位預測結果表明，NtCIPK2可能定位在質膜中。在茄子中，SmCIPK2也定位到質膜上[15]，也有研究表明CIPK2定位在質膜和細胞核[10，16]。

不同組織之間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05圖8 NtCIPK2在煙草不同組織中的相對表達量分析Fig.8 Analysis of relative expression of NtCIPK2 in different tissues of tobacco

同一處理不同時間點的數據間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Under the same treatment at different time, the bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05圖9 NtCIPK2在10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2處理下的相對表達量Fig.9 Relative expression of NtCIPK2 under10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2treatment

本研究利用qRT-PCR分析NtCIPK2在煙草K326不同組織中的表達水平，結果顯示該基因在根、莖、葉、花中均有表達，莖中表達量最高。這與白刺NtCIPK2表達不一樣，該基因在根中表達量最高[17]，原因可能與鹽生植物耐鹽性有關，白刺屬于鹽生植物。為保證植株正常生長，需從根部吸收更多水分和離子，通過細胞液中積累無機離子或合成有機溶質等方式進行滲透調節以減輕或避免傷害[18]；這與小麥TaCIPK2和TaCIPK25表達模式一致，該基因也在莖中表達最高[19-20]，推測煙草和小麥中NtCIPK2可能與莖中離子運輸有關。

本研究發現，在高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理下，NtCIPK2的表達量明顯上調，6 h達到最大，這與小麥TaCIPK2表達模式一致[21]，表明NtCIPK2表達受高鹽誘導。在1 μmol·L-1ABA處理下，NtCIPK2在0～12 h表達量降低，水稻OsCIPK2在ABA處理下表達量也先下調[22]。在5%PEG-6000模擬干旱處理下，NtCIPK2表達上調，3～24 h均受到誘導。有研究將大豆CIPK基因家族分為4個亞組，CIPK2屬于Ⅳ亞組，屬于Ⅳ亞組中的基因在干旱脅迫下反應明顯[23]。例如，用20%PEG-6000處理玉米ZmCIPK2，該基因在6 h誘導最強烈[11]；用15%PEG-6000處理大麥HbCIPK2，該基因在3～12 h顯著誘導，24 h小幅度下降[10]；但同樣處理下，白梨PbCIPK2表達則受到抑制，12～24 h逐漸下降至最低[24]，以上均說明CIPK2基因與植物干旱脅迫相關。進一步研究表明，TaCIPK2蛋白通過增強細胞膜穩定性和調節ROS清除系統來增強植物抗旱能力[20]；水稻OsCIPK的誘導模式與其干旱應激反應因子相關，OsCIPK23的過表達能誘導多種抗旱相關基因的表達，從而間接地參與對干旱的響應[25-26]。

低鉀(10 μmol·L-1K+)處理后，NtCIPK2表達量上調，12 h達到最大，表明NtCIPK2的表達受低鉀處理誘導。不同植物CIPK2表達模式不同，不同CIPK家族成員對低鉀脅迫反應不同。茄子SmCIPK2在低鉀處理后，表達量上調，6 h達到最大[15]。甘蔗SsCIPK23、水稻OsCIPK10和玉米ZmCIPK9在低鉀處理后其表達都被誘導[27-29]。但在低鉀處理下CIPK2被誘導的機制尚未明確，目前AtCBL1/AtCBL9-AtCIPK23信號系統研究得較清楚。當胞外K+濃度低時，AtCBL1和AtCBL9能夠通過與AtCIPK23互作，激活定位于質膜上的K+通道蛋白AtAKT1，促使K+內流進入細胞，進而調節低鉀條件下植物K+的吸收[30]。

本試驗選擇5種處理(10 μmol·L-1K+、5%PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA)以研究NtCIPK2的表達模式，在不同的脅迫條件，該基因表達情況發生改變，暗示了該基因在低鉀、干旱、鹽脅迫、H2O2和ABA脅迫下發揮重要作用。但NtCIPK2蛋白在其發揮的具體作用，尚待進一步研究。今后可構建GFP融合表達蛋白確定其亞細胞定位，通過酵母雙雜交實驗尋找與NtCIPK2互作的蛋白，深入研究NtCIPK2基因的功能，為從分子水平闡明NtCIPK2蛋白在非生物逆境脅迫中的作用機制提供科學依據。

[1] 司叢叢，劉好寶，曲平治.煙草鉀離子通道及轉基因煙草抗逆性的研究進展[J].中國農學通報， 2010，26(2):45-49.

SI C C， LIU H B， QU P Z. Research advances in potassium ion channel of tobacco and stress resistance of transgenic tobacco[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin， 2010，26(2):45-49. (in Chinese with English abstract)

[2] SANDERS D， PELLOUX J， BROWNLEE C， et al. Calcium at the crossroads of signaling[J].PlantCell， 2002，14(S):401-417.

[3] SHI J， KIM K N， RITZ O， et al. Novel protein kinases associated with calcineurin B-like calcium sensors inArabidopsis[J].PlantCell， 1999， 11(12): 2393-2405.

[4] LUAN S. The CBL-CIPK network in plant calcium signaling[J].TrendsinPlantScience， 2009， 14(1):37-42.

[5] GONG D， GUO Y， SCHUMAKER K S， et al. The SOS3 family of calcium sensors and SOS2 family of protein kinases inArabidopsis[J].PlantPhysiology， 2004， 134(3):919-926.

[6] GUO Y， HALFTER U， ISHITANI M， et al. Molecular characterization of functional domains in the protein kinase SOS2 that is required for plant salt tolerance[J].PlantCell， 2001， 13(6):1383.

[7] TANG R J， YANG Y， YANG L， et al. Poplar calcineurin B-like proteins PtCBL10A and PtCBL10B regulate shoot salt tolerance through interaction with PtSOS2 in the vacuolar membrane[J].PlantCell&Environment， 2014， 37(3):573-588.

[8] WEINL S， KUDLA J. The CBL-CIPK Ca2+decoding signaling network: Function and perspectives[J].NewPhytologist， 2009， 184(3): 517-528.

[9] YU Q Y， AN L J， LI W L.CBL-CIPK network mediates different signaling pathways in plants[J].PlantCellReports， 2014，33(2): 203-214.

[10] LI R， ZHANG J， WU G， et al. HbCIPK2， a novel CBL-interacting protein kinase from halophyte Hordeumbrevisubulatum， confers salt and osmotic stress tolerance.[J].PlantCell&Environment， 2012， 35(9):1582-1600.

[11] CHEN X F， GU Z M， XIN D D， et al. Identification and characterization of putative CIPK genes in maize[J].JournalofGeneticsandGenomics， 2011， 38(2):77-87.

[12] 閆亞飛. 煙草NtCIPK23基因的克隆、表達分析及轉基因過量表達研究[D]. 重慶：重慶大學， 2012.

YAN Y F. Clone， expression characterization and over-expressing transgenic study of tobaccoNtCIPK23 gene[D]. Chongqing: Chongqing University， 2012. (in Chinese with English abstract)

[13] ALBRECHT V， RITZ O， LINDER S， et al. The NAF domain defines a novel protein-protein interaction module conserved in Ca2+regulated kinases[J].EMBOJournal， 2001， 20(5):1051-1063.

[14] CHAVESSANJUAN A， SANCHEZBARRENA M J， GONZALEZRUBIO J M， et al. Structural basis of the regulatory mechanism of the plant CIPK family of protein kinases controlling ion homeostasis and abiotic stress[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 2014， 111(42):4532-4541.

[15] JING L， JIANG M M， LI R， et al. Identification and characterization of CBL， and CIPK， gene families in eggplant (SolanummelongenaL.)[J].MolecularGeneticsandGenomics， 2016， 291(4):1769-1781.

[16] OLIVER B， WAADT R， STEINHORST L， et al. CBL-mediated targeting of CIPKs facilitates the decoding of calcium signals emanating from distinct cellular stores[J].PlantJournal， 2010， 61(2):211-222.

[17] ZHENG L L， GAO Z， WANG J， et al. Molecular cloning and functional characterization of a novel CBL-interacting protein kinase NtCIPK2 in the halophyteNitrariatangutorum[J].Genetics&MolecularResearch， 2014， 13(3):4716-4728.

[18] 武維華.植物生理學[M].北京：科學出版社，2003.

[19] JIN X， SUN T， WANG X， et al. Wheat CBL-interacting protein kinase 25 negatively regulates salt tolerance in transgenic wheat[J].ScientificReports， 2016， 6:28884.

[20] YAN W， TAO S， LI T， et al. A CBL-interacting protein kinase TaCIPK2 confers drought tolerance in transgenic tobacco plants through regulating the stomatal movement[J].PlosOne， 2016， 11(12):1-20.

[21] 程西永，王曉曉，蘇鵬，等.小麥TaCIPK2基因克隆及與TaCBLs蛋白互作分析[J].分子植物育種， 2016， 14(7):1655-1665.

CHENG X Y， WANG X X， SU P， et al. Clone ofTaCIPK2 gene and analysis of interaction with TaCBLs protein in wheat[J].MolecularPlantBreeding， 2016， 14(7): 1655-1665. (in Chinese with English abstract)

[22] CHEN X F， GU Z M， LIU F， et al. Molecular analysis of rice CIPKs involved in both biotic and abiotic stress responses[J].RiceScience， 2011， 18(1):1-9.

[23] ZHU K， CHEN F， LIU J， et al. Evolution of an intron-poor cluster of the CIPK gene family and expression in response to drought stress in soybean[J].ScientificReports， 2016， 6:28225.

[24] TANG J， LIN J， LI H， et al. Characterization of CIPK family in Asian pear (PyrusbretschneideriRehd) and co-expression analysis related to salt and osmotic stress responses[J].FrontiersinPlantScience， 2016， 7:1361.

[25] XIANG Y， HUANG Y， XIONG L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement[J].PlantPhysiology， 2007， 144(3):1416-1428.

[26] YANG W， KONG Z， OMO-IKERODAH E， et al. Calcineurin B-like interacting protein kinase OsCIPK23 functions in pollination and drought stress responses in rice (OryzasativaL.)[J].JournalofGeneticsandGenomics， 2008， 35(9):531-543.

[27] 凌秋平，曾巧英，胡斐，等.甘蔗CIPK23基因克隆及對低鉀、干旱、鹽脅迫的響應[J].分子植物育種， 2015， 13(6):1329-1335.

LING Q P， ZENG Q Y， HU F， et al. Molecular cloning and expression analysis ofCIPK23 gene from sugarcane under low potassium， drought and salt stress[J].MolecularPlantBreeding， 2015， 13 (6): 1329-1335. (in Chinese with English abstract)

[28] 劉峰.水稻OsCIPK10基因的耐逆性功能分析[D]. 金華:浙江師范大學， 2010.

LIU F. Stress analysis ofOsCIPK10 gene in rice[D]. Jinhua: Zhejiang Normal University， 2010. (in Chinese with English abstract)

[29] 張翔. 玉米ZmCIPK9及ZmCBL8在非生物脅迫應答中的功能研究[D]. 北京:中國農業大學， 2016.

ZHANG X. Study on the function of maize ZmCIPK9 and ZmCBL8 in abiotic stress response[D].Beijing: China Agricultural University， 2010. (in Chinese with English abstract)

[30] YONG H C， PANDEY G K， GRANT J J， et al. Two calcineurin B-like calcium sensors， interacting with protein kinase CIPK23， regulate leaf transpiration and root potassium uptake in Arabidopsis[J].PlantJournal， 2007， 52(2):223-239.

CloningandexpressionanalysisofNtCIPK2geneinNicotianatabacum

ZHUO Wei， CHEN Qian， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)is a class of bioactive serine/ threonine protein kinase that interacts with the calcineurin B-like protein (CBL) to regulate the physiological activity of plants in adapting or resisting to abiotic stress. The homologous sequences were used to clone the full length cDNA ofNtCIPK2 gene in the tobacco cultivar K326， and qRT-PCR was used to analyze the tissue-specific and abiotic stress expression pattern ofNtCIPK2. The results showed that this gene contained 1 341 bp and encoded 446 amino acid. The predicted molecular weight was 50.3 ku and the isoelectric point (pI) was 8.90. The homology analysis showed that the protein had 95% homology withNicotianatomentosiformisCIPK2， thus it was named asNtCIPK2. Bioinformatics analysis showed that NtCIPK2 was a hydrophilic protein whose N-terminus contained a conserved active loop domain S_TKc and the C-terminus contained the regulatory domain CIPK-C， and might be localized in the plasma membrane. Expression patterns showed that the gene was expressed in roots， stems， leaves and flowers in mature stage， which has the highest expression in stems. Expression patterns under abiotic stress indicated the gene expression was induced by low-potassium， high-salt， drought， H2O2and ABA treatment， and involved in the response to abiotic stress inNicotianatabacum.

tobacco;NtCIPK2; cloning; bioinformatics; gene expression

S572

A

1004-1524(2017)10-1597-08

（責任編輯張 韻)