泛素特異蛋白酶20在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

周方方，朱曉華，榮欣欣，劉家有，楊懿，候令密，謝少利，鄧世山

(1.川北醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

泛素特異蛋白酶20在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

周方方1，朱曉華1，榮欣欣1，劉家有1，楊懿1，候令密2，謝少利2，鄧世山1

(1.川北醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

目的通過(guò)分析乳腺癌的臨床病理特征及觀察乳腺癌組織細(xì)胞中泛素特異蛋白酶20(ubiquitin-specific proteases 20，USP20)的表達(dá)情況，探討二者間的關(guān)系及USP20的臨床意義。方法收集經(jīng)臨床病理確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的乳腺癌組織標(biāo)本42例，同時(shí)選取癌旁相對(duì)正常組織作為對(duì)照；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)USP20在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果42例乳腺癌組織中，27例(64.29%)USP20呈陽(yáng)性表達(dá)，與癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)(21.43%)相比顯著增加(χ2=15.75，P<0.01)；病理分型中，低分化與高、中分化的總和比較，USP20陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加(P<0.05)；臨床分期越晚，USP20陽(yáng)性表達(dá)率越高(χ2=8.571，P<0.05)。結(jié)論乳腺癌組織中USP20陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期有密切關(guān)系，提示USP20與乳腺癌惡性程度成正相關(guān)，這為臨床治療、預(yù)后及進(jìn)一步研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

乳腺癌；泛素特異性蛋白酶20；臨床分期；分化程度

乳腺癌發(fā)病率逐年提高，病情嚴(yán)重，死亡率高，嚴(yán)重威脅著女性患者的生命健康，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前研究主要集中在雌激素受體、腫瘤干細(xì)胞及各種信號(hào)通路[1-2]等，雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，而且很難應(yīng)用于臨床。隨著科技的發(fā)展、預(yù)防和防范意識(shí)不斷提高，乳腺癌的治愈率也有所提高，但是許多乳腺癌患者由于腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，其治療效果仍然不理想。泛素特異蛋白酶20(ubiquitin-specific proteases 20，USP20)是泛素特異性蛋白酶家族中的一員，參與調(diào)控底物蛋白在人體內(nèi)的產(chǎn)生與降解的動(dòng)態(tài)平衡，從而維持正常生命活動(dòng)。目前USP20對(duì)腫瘤的作用及相關(guān)機(jī)制的研究較少，在乳腺癌組織細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色與臨床病例查閱方法，分析乳腺癌的臨床病理特征及觀察乳腺癌組織細(xì)胞中USP20的表達(dá)情況，以探討二者間的關(guān)系及USP20的臨床意義。

1 材料方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

收集2014年1月至2015年12月在本校附屬醫(yī)院經(jīng)病理科確診的浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌石蠟包埋標(biāo)本42例。由于某些臨床資料的缺失，42例患者中能夠明確分子分型的共有34例，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的共有35例，明確WHO分級(jí)的共有39例，其它資料完整。根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)和KI-67的表達(dá)情況將乳腺癌分成4種分子亞型即Luminal A型[ER(+)或PR(+)且HER2(-)，KI-67低表達(dá)(<14%)]，Luminal B型[ER(+)或PR(+)且HER2(-)，KI-67高表達(dá)(≥14%)，或者ER(+)或PR(+)且HER2(+)，KI-67任意水平]，HER-2過(guò)表達(dá)型[ER(-)、PR(-)且HER2(+)，KI-67任意水平]，三陰性[ER(-)、PR(-)且HER2(-)]。本次收集的臨床標(biāo)本Luminal A型有11例，Luminal B型12例，HER-2過(guò)表達(dá)型5例，三陰性6例。有淋巴轉(zhuǎn)移的13例，無(wú)轉(zhuǎn)移的22例。低分化16例，中分化21例，高分化2例。42例患者中男性1例，女性41例；年齡36～88歲，中位年齡49歲。腫瘤大小T1期14例，T2期18例，T3期3例，T4期7例。臨床分期I期7例，II期18例，III期14例，IV期3例。同時(shí)在42例乳腺癌病例中，選取經(jīng)病理確診的癌旁組織42例。

1.2免疫組化試劑及操作

切片常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水常溫10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，PBS漂洗后10%的羊血清37 ℃ 10 min封閉非特異性抗原，滴加兔抗-USP20多克隆抗體(1∶50，Proteintech公司)一抗4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS漂洗后滴加二抗(山羊抗兔IG,即用液， pv-6001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃恒溫箱中40 min，PBS漂洗，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。最后鏡下觀察并拍照。

1.3免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)果判定采用二級(jí)計(jì)分法[3]。染色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)顯色為0分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為≤5%為0分；>5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分。兩者計(jì)分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為陽(yáng)性(++)；9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。為了便于統(tǒng)計(jì)，將陰性和弱陽(yáng)性定義為陰性(-)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性定義為陽(yáng)性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1癌組織和癌旁組織中USP20陽(yáng)性表達(dá)差異比較

USP20免疫組化結(jié)果(圖1)顯示乳腺癌組織中癌巢周圍USP20大量表達(dá)，并且呈樹(shù)根狀向遠(yuǎn)處擴(kuò)散，陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈片狀、彌散分布，著色深淺程度不一，細(xì)胞核中僅有少量表達(dá)。與42例癌旁組織比較，42例乳腺癌組織中USP20陽(yáng)性表達(dá)率(27/42,64.29%)顯著高于癌旁組織(9/42,21.43%)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.75，P<0.01)。

2.2乳腺癌組織中USP20的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

免疫組織化學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，USP20在人乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、T分級(jí)、分子分型和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。與腫瘤分化程度有關(guān)，腫瘤分化程度越低，USP20陽(yáng)性表達(dá)率越高，其中低分化與高+中分化比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)；與臨床分期有關(guān)，臨床分期越晚，USP20陽(yáng)性表達(dá)率越高(χ2=8.571，P<0.05)(表1)。

3 討論

蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種廣泛存在且非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，調(diào)控許多生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)、炎癥過(guò)程[4-5]等。蛋白質(zhì)的泛素化是一個(gè)可逆的過(guò)程，去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)通過(guò)對(duì)底物蛋白的去泛素化來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的壽命，穩(wěn)定泛素蛋白酶體系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，其表達(dá)紊亂是誘發(fā)多種疾病的主要原因。細(xì)胞內(nèi)廣泛存在多種DUBs，按結(jié)構(gòu)的不同可以分為5種類型，其中泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USPs)是DUBs中成員最多且結(jié)構(gòu)最多樣的一類[6]。既往研究[4-5,7-8]表明USP2a、USP7、USP22、USP28、USP9x等在多種腫瘤中異常表達(dá)，且影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其相關(guān)作用機(jī)制主要與P53、NF-κB、HIF-1α、AKT、STAT、mTOR、Smad、c-MYC等有關(guān)。

表1 USP20蛋白陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

臨床特征例數(shù)陰性表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)χ2值P值性別1.00b 男性101 女性411526年齡(歲)1.6740.196a ≤6029821 >601376分子分型1.8300.671b LuminalA1147 LuminalB12210 HER-2過(guò)表達(dá)523 三陰性624WHO分級(jí)0.049b* 高211 中211110 低16313T分級(jí)0.954a0.329a** T11595 T219513 T3212 T4616臨床分期8.571c0.003c I761 II18612 III14311 IV303淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.292b -22616 +1367

a.連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)；b.Fisher 確切概率；c.線性趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)；*.低分化與高、中分化總和比較；**.T1、T2總和與T3、T4總和比較。

USP20作為USPs家族中的1員，對(duì)腫瘤的作用及相關(guān)機(jī)制的研究較少，在乳腺癌中尚未見(jiàn)報(bào)道。2011年Yasunaga等[9]報(bào)道USP20對(duì)TRAF6和致癌蛋白TAX具有去泛素化作用，并且可以抑制IL-1β和致癌蛋白TAX誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。2015年Kim等[10]最新研究報(bào)道中指出USP20對(duì)PKM2具有去泛素化作用，并且提出USP20與PKM2的相互作用可能是調(diào)節(jié)腫瘤代謝的一個(gè)新的分子信號(hào)通路。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌患者中癌巢周圍USP20大量表達(dá)，并且呈樹(shù)根狀向遠(yuǎn)處擴(kuò)散，提示USP20可能影響乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；另外本次實(shí)驗(yàn)研究分析發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌患者中，腫瘤分化程度越低、臨床分期越晚USP20陽(yáng)性表達(dá)率越高，表明USP20可能具有促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的作用。

低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作為核轉(zhuǎn)錄因子中的一種，調(diào)控多種靶向基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)機(jī)體內(nèi)氧平衡的調(diào)節(jié)起重要作用。常氧狀態(tài)下HIF-1α受pVHL蛋白依賴的泛素-蛋白酶體系降解而不穩(wěn)定，缺氧時(shí)HIF-1α的降解受到抑制[11]。有研究[12-13]表明HIF-1α在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、新血管的生成、和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。2005年Li等[14]研究報(bào)道中指出USP20可以將已經(jīng)泛素化的HIF-1α去泛素化，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白， 提高HIF-1α水平，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α目的基因(eg.VEGF)的表達(dá)。隨后2013年P(guān)ark等[15]采用USP20的單克隆和多克隆抗體對(duì)USP20的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，報(bào)道中指出USP20可通過(guò)抑制pVHL蛋白介導(dǎo)的HIF-1α這一降解過(guò)程，從而穩(wěn)定HIF-1α。基于本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前期學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)USP20可能通過(guò)去泛素化HIF-1α，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α目的基因的表達(dá)，從而影響乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，但其具體分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集經(jīng)臨床病理科確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的乳腺癌組織標(biāo)本42例，同時(shí)選取癌旁相對(duì)正常組織作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)USP20在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中USP20陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期有密切關(guān)系，提示USP20與乳腺癌惡性程度成正相關(guān)，這為臨床治療、預(yù)后及進(jìn)一步研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

盡管USP20在乳腺癌中具體作用及相關(guān)機(jī)制仍不清楚，但是隨著USP20在乳腺癌中的研究逐步深入，應(yīng)用藥物或基因工程等技術(shù)誘導(dǎo)或者抑制USP20表達(dá)作為治療乳腺癌的新思路具有一定的臨床意義。

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ExpressionofUSP20inhumanbreastcanceranditssignificance

ZHOU Fang-fang1,ZHU Xiao-hua1,RONG Xin-xin1,LIU Jia-you1,YANG Yi1,HOU Ling-mi2,XIE Shao-li2,DENG Shi-shan1

(1.DepartmentofAnatomy,NorthSichuanMedicalCollege;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMadicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To observer the relationship between the clinical pathological characteristics of breast cancer and the expression of ubiquitin-specific protease 20 (USP20) to clarify the function of USP20 in breast cancer.Methods42 specimens invasive ductal carcinoma from breast cancer patients were selected,and 42 specimens from para-cancer tissue were chosen as control.Expression of USP20 was detected with immunohistochemical staining.ResultsThe positive expression rate of USP20 in breast cancer patients was 64.29%,which was higher than that in para-cancer tissue(21.43%).The difference was significant(χ2=15.75，P<0.01).Compared with the sum of high and medium differentiation,the positive expression rate of USP20 in low differentiated group was higher(P<0.05).Moreover,the later clinical stage,the higher rate was the positive expression of USP20(χ2=8.571，P<0.05).ConclusionThe high expression rate of USP20 in human breast cancer is associated with differentiation and clinical stage of the cancer,suggesting that USP20 is positively correlated with the malignancy of breast cancer,which may provide important experimental basis for clinical treatment,prognosis and further research.

Breast cancer;Ubiquitin-specific proteases 20;Clinical stage；Differentiation

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.003

四川省教育廳一般項(xiàng)目(17ZB0175)；四川省教育廳科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(17TD0016)；川北醫(yī)學(xué)院校級(jí)發(fā)展項(xiàng)目(CBY15-A-2017)

2017-06-08

周方方(1987-),女，碩士，助教。

鄧世山，E-mail:805206372@qq.com

時(shí)間： 2017-10-10 02∶27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0227.008.html

1005-3697(2017)05-0659-04

R737.9

A

(學(xué)術(shù)編輯劉紅)

本刊網(wǎng)址：http：//www.nsmc.edu.cn作者投稿系統(tǒng)http：//noth.cbpt.cnki.net郵箱xuebao@nsmc.edu.cn

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